Подводная Печать клеток на модифицированной поверхности с помощью непрерывного потока Microspotter

Общая цель этой процедуры заключается в печати трех Т-трех фибробластов на поверхности, покрытой сывороткой. Это достигается путем предварительного нанесения сыворотки предварительной адсорбции на поверхность культуры ткани. Второй шаг заключается в нанесении суспензии фибробластов на поверхность с помощью микроспоттера непрерывного действия с последующей инкубацией клеток при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов.

Затем напечатанные клетки, а также клетки, засеянные с помощью стандартной клеточной культуры, окрашиваются йодидом пропидия и визуализируются под инвертированным микроскопом для сравнения. В конечном счете, флуоресцентная микроскопия используется для оценки жизнеспособности, плотности и морфологии клеток в соответствующие моменты времени. Основное преимущество этой технологии по сравнению с существующими методами, такими как печать на булавках, заключается в том, что печатающая головка образует уплотнение на поверхности, что позволяет печатать ячейки во время погружения в питательную среду.

В то время как погружная печать клеток полезна для скрининга новых кандидатов в лекарственные препараты на безопасность и эффективность, погружная печать в целом также полезна для других применений. Например, мы можем анализировать новые кандидаты в лекарства на фоне срезов тканей или использовать их в качестве модели для систем органов. Например, модель обильности печени.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что во время грунтовки принтера и печати клеток воздух не может попасть в линии или может вызвать гибель клеток. Для начала NIH три Т три клетки в течение двух-трех минут на встряхивающей водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах полной среды и центрифугируйте при 1500 G в течение трех минут.

Удалите надосадочную жидкость клетки, не потревожив клеточную гранулу. Затем повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах среды и перенесите 10 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитров. Далее добавьте в клеточную суспензию 10 микролитров триама синего и размешайте кончиком пипетки-пипетки 10 микролитров окрашенных клеток в камере гемоцитометра.

Прежде чем подсчитывать ячейки с 10-кратным увеличением, посчитайте живые ячейки, которые напоминают маленькие белые шарики на четырех из девяти больших квадратов. Учитывайте только те живые клетки, которые не выглядят темно-синими из-за синего пятна триппена. Рассчитайте среднее количество клеток на большой квадрат, в результате чего количество клеток умножить на 10 000 клеток на миллилитр в исходной клеточной суспензии.

Затем затравливаются клетки с плотностью 100 000 клеток на миллилитр с общим количеством пяти миллилитров в каждой колбе Т 25. Перед началом экспериментов культивируйте клетки до уровня от 70 до 80% плавности. Для подготовки печатной поверхности с помощью маркера следует отметить прямоугольник размером с печатающую головку на дне ткани, обработанной культурой полистирола 12.

Хорошо наденьте пипеткой 50 микролитров фетальной бычьей сыворотки на прямоугольный участок и распределите его по всей области. С помощью наконечника оставьте планшет для лунки в стерильном биозащитном колпаке на ночь, чтобы пятно сыворотки полностью высохло. Чтобы начать печать под водой, промойте печатающую головку дистиллированной водой.

Затем наполните 60-миллиметровую чашку Петри дистиллированной водой и пристыкуйте печатающую головку к поверхности, чтобы пролить дистиллированную воду через каждую из линий в течение двух минут со скоростью 150 микролитров в минуту с помощью пневматического насоса. Затем слейте воду из чашки Петри и наполните ее чистой водой. Затем трижды переместите печатающую головку вверх и вниз в воде.

Прикрепите центр печатающей головки к пятну, покрытому сывороткой, в заранее подготовленной 12-луночной пластине. Затем загрунтуйте печатающую головку с помощью Prewarm. Готовый медиа по 300 микролитров на канал.

При выполнении нескольких отпечатков добавьте отбеливающий ополаскиватель в дополнение к водному ополаскивателю между отпечатками. Приступайте к печати взвешенных клеток в концентрации 50 000 клеток на миллилитр на поверхность и со скоростью 60 микролитров в минуту. 100 микролитров на канал.

После клеточной печати поместите печатающую головку, оставленную пристыкованной к поверхности, и коллектор в инкубатор для клеточных культур. Установите на 5% углекислого газа и 37 градусов Цельсия на два часа. После двухчасовой инкубации снимите печатающую головку и накройте чашку для культуры крышкой.

Время извлечения печатающей головки считается точкой нулевого часа. Для сравнения также проводится стандартная клеточная культура. Добавьте один миллилитр предварительно подогретой среды в одну из 12-луночных пластин сыворотки, затем возьмите один миллилитр оставшейся клеточной суспензии и пипетируйте ее в одну лунку из 12-луночной пластины.

В результате получится культура, содержащая 50 000 клеток в чашке. Поместите планшет для культивирования клеток в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на два часа. После двухчасовой инкубации начните отсчитывать время для обеспечения согласованности между напечатанными и посевными образцами.

Это считается временной точкой нулевого часа. Через 0, 2, 24 и 48 часов подготовьте клетки каждого из двух методов визуализации путем окрашивания йодидом пропидия, который встраивается только в ядро мертвых клеток. Во-первых, аккуратно промойте клетки три раза одним миллилитром фосфатного воздушного раствора с кальцием и магнием, чтобы удалить любой мусор.

Далее в каждый питательный сосуд добавьте по одному миллилитру предварительно подогретой питательной среды, а затем по одному микролитру йодида пропидиума. Стоковым раствором инкубируют клетки, окрашенные йодидом пропидия при 37 градусах Цельсия, в течение 10 минут перед визуализацией клеток с помощью инвертированного микроскопа при 10-кратном и 40-кратном увеличении. Наконец, выбросьте клетки в подходящий контейнер для биологически опасных веществ.

Клеточную линию фибробластов, три Т-три клетки NIH, печатали или засеивали на погружную поверхность. После печати и посева клетки были визуализированы для оценки плотности и морфологии в соответствующие моменты времени. Изображения показали, что клетки обладают почти идентичными фенотипами в каждый момент времени и при каждом увеличении.

На основании этих цифр было определено, что эффективная печать минимальна. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью окрашивания йодидом пропидия и показали, что жизнеспособность напечатанных клеток существенно не отличалась от сидячих клеток для каждого временного момента. Основное различие между двумя методами прикрепления клеток к поверхности заключается в плотности ячеек.

Плотность напечатанных ячеек уменьшается за два часа более чем на 50% как в сидячих, так и в печатных ячейках. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить причину этого снижения. Тем не менее, общее соотношение плотности печати по сравнению с затравленным остается значительно выше.

Плотность напечатанных ячеек в проточной ячейке была примерно в 10 раз плотнее в каждый момент времени, чем затравленные ячейки, рассматривающие ячейки, печатались с той же плотностью, что и затравка, но на меньшей площади. В конечном моменте времени клетки имеют одинаковую плотность, что, вероятно, связано с подвижностью клеток и ограничениями потребления ресурсов. С момента своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области разработки лекарств для изучения влияния токсичности и эффективности лекарств на клетки и раковые средства, сердечные заболевания и другие области, пользующиеся большим спросом.

Используя погружную клеточную печать в сочетании с другими технологиями, такими как адгезия, программируемая клеточная адгезия, мы можем расширить охват этого метода до суспензионных клеток для расширенного поиска лекарств и скрининга разработки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как печатать ячейки с помощью нашей техники погружной печати.