Подводная Печать клеток на модифицированной поверхности с помощью непрерывного потока Microspotter

Общая цель данной процедуры заключается в печати фибробластов линии T3 на поверхность, покрытую сывороткой. Это достигается путем предварительной адсорбции сыворотки на поверхность для культивирования тканей. На втором этапе суспензия фибробластов наносится на поверхность с помощью микроспоттера с непрерывным потоком, после чего следует инкубация клеток при 37 °C в течение двух часов.

Затем напечатанные клетки, так же как и клетки, высеянные стандартным методом культивирования, окрашивают пропидиййодидом и визуализируют с помощью инвертированного микроскопа для сравнения. В конечном итоге используют флуоресцентную микроскопию для оценки жизнеспособности, плотности и морфологии клеток в соответствующие временные точки. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как контактная печать (pin printing), является то, что печатающая головка создает герметичное уплотнение с поверхностью, что позволяет осуществлять печать клеток при их погружении в культуральную среду.

Хотя погружная печать клеток полезна для скрининга новых лекарственных кандидатов на безопасность и эффективность, погружная печать в целом применима и для других целей. Например, с ее помощью можно анализировать действие новых лекарственных кандидатов на срезы тканей или использовать ее в качестве модели органных систем. Примером может служить модель перфузии печени.

Как правило, специалисты, впервые использующие данный метод, сталкиваются с трудностями, так как при подготовке принтера и печати клеток в линии не должен попадать воздух, поскольку это может привести к гибели клеток. Для начала разморозьте клетки NIH 3T3 в течение двух-трех минут в шейкере с водяной баней при 37 °C. Ресуспендируйте клетки в 5 мл полной среды и центрифугируйте при 1500 ×g в течение трех минут.

Удалите супернатант, не затрагивая осадок клеток. Затем ресуспендируйте клетки в 5 мл среды и перенесите 10 µL клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл. Далее добавьте к клеточной суспензии 10 µL красителя трипан синий и перемешайте кончиком пипетки; затем перенесите 10 µL окрашенных клеток в камеру гемоцитометра.

Перед подсчетом клеток при 10-кратном увеличении подсчитайте живые клетки, которые выглядят как маленькие белые шарики, в четырех из девяти больших квадратов. Учитывайте только живые клетки, которые не окрашены в темно-синий цвет красителем трипановым синим. Вычислите среднее количество клеток на один большой квадрат; полученное значение, умноженное на 10 000, будет соответствовать количеству клеток на миллилитр в исходной клеточной суспензии.

Затем проведите посев клеток с плотностью 100 000 клеток на мл, используя общий объем пять мл в каждом флаконе T 25. Культивируйте клетки до достижения конфлюэнтности от 70 до 80% перед началом экспериментов. Для подготовки поверхности печати с помощью маркера отметьте на дне полистирольного планшета 12 с обработкой для культивирования тканей прямоугольник по размеру печатающей головки.

С помощью дозатора внесите 50 µL фетальной бычьей сыворотки в прямоугольную область луночного планшета и распределите её по всей этой зоне. Оставьте планшет в стерильном боксе биологической безопасности на ночь, чтобы пятно сыворотки полностью высохло. Для начала погружной печати промойте печатающую головку дистиллированной водой.

Затем наполните чашку Петри диаметром 60 мм дистиллированной водой и опустите печатающую головку на поверхность; с помощью пневматического насоса прокачивайте дистиллированную воду через каждую линию в течение двух минут со скоростью 150 µL/min. После этого слейте воду из чашки Петри и наполните ее чистой водой. Затем переместите печатающую головку вверх и вниз в воде три раза.

Установите печатающую головку по центру пятна с нанесенной сывороткой в предварительно подготовленном 12-луночном планшете. Затем промойте печатающую головку с помощью Prewarm. Полная среда в объеме 300 µL на канал.

При выполнении нескольких отпечатков между ними, помимо промывки водой, добавьте промывку отбеливателем. Приступите к печати суспендированных клеток с концентрацией 50, 000 cells per milliliter на поверхность со скоростью 60 µL per minute. 100 µL на канал.

После печати клеток поместите печатающую головку в левое доковое положение вплотную к поверхности, а коллектор — в инкубатор для культур клеток. Установите параметры: 5% carbon dioxide и от 37 градусов Цельсия в течение двух часов. По истечении двухчасовой инкубации извлеките печатающую головку и накройте чашку с культурой крышкой.

Момент извлечения печатающей головки считается нулевой временной точкой. Для сравнения также проводится стандартное культивирование клеток. Добавьте 1 mL предварительно нагретой среды в одну из 12-луночных планшетов с нанесенной сывороткой, затем возьмите 1 mL оставшейся клеточной суспензии и перенесите ее пипеткой в одну лунку 12-луночного планшета.

В результате в чашке будет получена культура, содержащая 50 000 клеток. Поместите планшет с клеточной культурой в инкубатор при 37 °C на два часа. По истечении двухчасовой инкубации начните отсчет времени для обеспечения согласованности между образцами для печати и посева.

Этот момент времени считается нулевым. Через 0, 2, 24 и 48 часов подготовьте клетки, полученные обоими методами, для визуализации путем окрашивания пропидиййодидом, который встраивается только в ядра погибших клеток. Сначала осторожно промойте клетки трижды одним миллилитром фосфатно-солевого буферного раствора с добавлением кальция и магния для удаления остаточного клеточного детрита.

Затем добавьте по 1 mL предварительно нагретой культуральной среды в каждый культуральный сосуд, а затем по 1 µL пропидиййодида из стокового раствора. Инкубируйте клетки, окрашенные пропидиййодидом, при 37 °C в течение 10 минут, после чего проведите визуализацию клеток с помощью инвертированного микроскопа при 10-кратном и 40-кратном увеличении. В завершение утилизируйте клетки в соответствующий контейнер для биоопасных отходов.

Линию фибробластов NIH 3T3 распечатывали или высевали на погруженную поверхность. После распечатывания и высева клетки визуализировали для оценки плотности и морфологии в соответствующие моменты времени. Изображения показали, что клетки обладают почти идентичными фенотипами в каждой временной точке и при каждом увеличении.

На основании этих данных было установлено, что эффективность печати была минимальной. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью окрашивания пропидиййодидом, и результаты показали, что жизнеспособность напечатанных клеток существенно не отличалась от жизнеспособности высеянных клеток в каждой временной точке. Основным различием между двумя методами прикрепления клеток к поверхности была плотность клеток.

Плотность напечатанных клеток через два часа снижается более чем на 50% как в группе посева, так и в группе печати. Для определения причины этого снижения требуются дальнейшие исследования. Тем не менее, общие коэффициенты плотности напечатанных клеток по сравнению с посевными остаются значительно более высокими.

Плотность напечатанных клеток в проточной кювете в каждой временной точке была примерно в 10 раз выше, чем плотность посеянных клеток, поскольку клетки печатались с той же плотностью, что и при посеве, но на меньшей площади. В конечной временной точке плотность клеток выравнивается, что, вероятно, обусловлено подвижностью клеток и ограничениями в потреблении ресурсов. С момента своей разработки этот метод открыл исследователям в области разработки лекарственных средств возможность изучать эффекты токсичности и эффективности препаратов на клетках, а также проводить исследования в таких востребованных областях, как борьба с раком, сердечно-сосудистые заболевания и другие.

Используя метод погружного печатания клеток в сочетании с другими технологиями, такими как адгезия и программируемая клеточная адгезия, мы можем распространить применение данного метода на суспензионные клетки для расширения скрининга в области поиска и разработки лекарственных препаратов. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как печатать клетки с помощью нашей методики погружной печати.