Ассамблея и применение "Shear колец": Роман эндотелиальной Модель для Orbital, однонаправленные и периодического потока жидкости и напряжения сдвига

Общая цель данной модели заключается в создании простого и экономичного метода для изучения периодического потока жидкости и напряжения сдвига на эндотелиальных клетках In Vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области физиологии эндотелиальных клеток, например, как периодический сдвиг влияет на форму, структуру и функционирование эндотелиальных клеток.

Основным преимуществом данной методики является использование просто сконструированного устройства для культивирования тканей, которое обеспечивает относительно большую площадь поверхности для оценки клеточных ответов. Эту процедуру продемонстрирует г-н Люк Уайт, студент медицинского факультета, работающий в моей лаборатории. Начните процедуру с использования программы для создания презентаций, чтобы разработать шаблон конструкции кольца сдвига с внешним контуром 150 millimeter и внутренним диаметром 100 millimeter, расположенным в центре круга диаметром 150 millimeter.

Распечатайте шаблон на листе белой бумаги формата A4. Работая в вытяжном шкафу с надлежащей вентиляцией и в перчатках, пипеткой перенесите 10 миллилитров хлорметана в стеклянную чашку Петри диаметром 150 миллиметров. Важно использовать именно стеклянную чашку, так как хлорметан растворяет большинство видов пластика.

Поместите пластиковую чашку Петри диаметром 150 мм на внешний шаблон для стрижки. С помощью бормашины просверлите отверстие диаметром 3 мм в центре чашки диаметром 100 мм. Удалите всю пластиковую стружку, образовавшуюся в результате сверления.

Удерживая чашку Петри диаметром 100 мм рукой в перчатке, переверните ее и погрузите верхний край чашки в слой метиленхлорида примерно на три секунды. Дайте излишкам метиленхлорида стечь с чашки диаметром 100 мм, после чего быстро перенесите увлажненный край чашки на центр чашки диаметром 150 мм. Осторожно совместите чашку диаметром 100 мм с отмеченным шаблоном.

Осторожно несколько раз поверните чашку диаметром 100 мм по часовой стрелке и против нее, чтобы обеспечить надежное прилипание к чашке диаметром 150 мм. После высыхания метиленхлорида переверните соединенные чашки Петри и внимательно осмотрите точки контакта. Если герметичное уплотнение образовалось не полностью, введите 0,5 мл метиленхлорида через отверстие диаметром 3 мм с помощью трансфер-пипетки.

Возьмите чашку и осторожно поверните ее, чтобы метиленхлорид достиг края. Убедившись, что между двумя чашками Петри образовалось плотное уплотнение, герметизируйте отверстие в чашке диаметром 100 мм, нанеся слой силиконового герметика шириной 3 мм. С помощью роторного инструмента с плоской режущей головкой срежьте верхние 3 см конической полистирольной пробирки для культивирования тканей диаметром 15 мм, оставив не менее одного сантиметра пробирки под колпачком.

Используйте плоскую сторону режущей головки, чтобы отполировать край разрезанной пробирки до достижения гладкости и ровности. Удалите все пластиковые стружки, образовавшиеся в результате шлифовки. С помощью маркера обведите отрезанную коническую пробирку объемом 15 milliliter на крышке чашки диаметром 150 millimeter примерно в 0.5 centimeters от края чашки.

Просверлите отверстие внутри нарисованного круга, оставив отступ примерно один-два миллиметра от края круга. Поместите отрезанную верхнюю часть конической трубки поверх просверленного отверстия. С помощью переносной пипетки нанесите примерно одну четвертую миллилитра или 250 µL метиленхлорида на обрезанные края конической трубки, чтобы приклеить трубку к крышке диаметром 150 мм.

Наконец, загерметизируйте крышку диаметром 150 миллиметров на чашке диаметром 150 миллиметров, нанеся слой силиконового герметика толщиной один миллиметр по внутреннему краю верхней чашки Петри. На схеме показано собранное уплотнительное кольцо. Синим цветом обозначена область с высеянными эндотелиальными клетками.

Внешняя и внутренняя красные стрелки указывают на орбитальное движение кольца сдвига и среды внутри него при размещении на орбитальном шейкере. Подготовьтесь к стерилизации, внеся пипеткой примерно 10 миллилитров PBS в недавно изготовленное кольцо сдвига через порт конической пробирки объемом 15 миллилитров. Повращайте содержимое, чтобы удалить любые загрязнения внутри кольца сдвига.

Удалите PBS с помощью пипетки Пастера и вакуумного аспиратора. Повторяйте промывку PBS до полного удаления всего клеточного дебриса. Для стерилизации режущего кольца будет использована комбинация промывки 70% этанолом и УФ-облучения.

Открутите вентиляционную крышку, внесите с помощью пипетки примерно 10 миллилитров 70% ethanol через смотровое отверстие и снова закрутите крышку. Несколько раз вращайте и переворачивайте кольцо для обреза, чтобы внутренние поверхности кольца были тщательно промыты. Внутри ламинарного шкафа для культивирования тканей аспирируйте излишки 70% ethanol.

С помощью распылителя тщательно обработайте порт доступа и крышку 70% ethanol. Затем поместите сдвигающее кольцо и крышку под УФ-излучение в ламинарном шкафу для культивирования тканей до полного высыхания. После того как сдвигающее кольцо высохнет, закрутите крышку обратно.

Храните стерилизованные кольца для создания напряжения сдвига при комнатной температуре до их использования для посева клеток. Для подготовки к исследованию напряжения сдвига сначала посейте эндотелиальные клетки в стерилизованные кольца в соответствии со стандартным протоколом культивирования клеток. Дождитесь достижения культурой состояния конфлюэнтности перед началом исследований потока.

Когда клетки достигнут конфлюэнтности, поместите экспериментальные кольца для создания сдвига на орбитальный шейкер, расположенный на нижней полке инкубатора, чтобы минимизировать вибрацию и механическое воздействие на полку. Поместите кольца группы статического контроля в тот же инкубатор. Оставьте кольца на шейкере на время, необходимое для воздействия сдвигового напряжения.

После того как слои клеток подвергались сдвигу в течение необходимого времени, извлеките кольца для создания сдвига из инкубатора. Снимите крышку кольца и заберите клетки и/или среду для проведения анализа в конечной точке. Обратите внимание, что после открытия колец для сдвига исследователи могут собирать клетки и среду для анализа несколькими способами.

Представлены репрезентативные результаты внешнего вида монослоев эндотелиальных клеток головного мозга человека CMEC D3 в сдвиговых кольцах после 48 часов периодического воздействия потока жидкости или статического воздействия; было замечено, что выравнивание культуры не всегда параллельно направлению потока, указанному стрелками. Некоторые реакции на периодический сдвиг показаны на монослоях микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки крысы. 72 часа периодического воздействия потока жидкости в сдвиговых кольцах привели к значительному снижению уровня молекулы адгезии тромбоцитов к эндотелиальным клеткам относительно контрольного белка Beta-actin.

После освоения метода изготовление нескольких сдвиговых колец может занять около трех часов при правильном выполнении. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости тщательного совмещения внутренней чашки с внешней для обеспечения герметичного уплотнения между ними. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как изготовить и использовать сдвиговые кольца в качестве простого метода проведения исследований периодического тока жидкости и напряжения сдвига in vitro на эндотелиальных клетках. Не забывайте, что работа с хлористым метиленом может быть опасной, и при выполнении этапов, требующих его использования, всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу.