Высокопроизводительный роботизированная Изоляция термочувствительных Смертельное Мутанты в

Общая цель данной процедуры заключается в использовании робототехники и стандартизированных анализов для оптимизации выделения температурно-чувствительных летальных мутаций у Chlamydomonas с целью определения жизненно важных генов и путей в этом организме. Нас интересуют как консервативность, так и дивергенция основных клеточных функций у эукариот. Для изучения этих аспектов мы используем мутации, нарушающие работу эссенциальных генов в данных процессах.

Для того чтобы это работало эффективно, необходима действительно обширная коллекция мутантов, и методы, о которых вы сейчас услышите, представляют собой наш способ создания такой коллекции. Мы работаем с зелеными водорослями Chlamydomonas reinhardtii как с представителем царства растений. Главное преимущество данной методики заключается в том, что температуры-чувствительные летальные мутации, вероятно, могут быть обнаружены в каждом жизненно важном метаболическом пути.

Метод не требует предварительных знаний или направленного мутагенеза. Молекулярная функция мутировавшего гена определяется непосредственно исходя из летального фенотипа. Это позволяет нам отбирать интересные мутации, нарушающие различные пути сиалирования, помимо контроля клеточного цикла.

Для проведения УФ-мутагенеза культивируйте клетки Chlamydomonas в 100 миллилитрах трис-ацетат-фосфатного (TAP) буфера до достижения OD 750 от 0.2 до 0.5 при освещении, температуре 25 °C и перемешивании со скоростью 100 RPM. УФ-мутагенез проводится независимо для двух генетических линий в соответствии с текстовым протоколом. Проверьте образец каждой культуры под микроскопом, чтобы убедиться в жизнеспособности клеток и отсутствии контаминации.

Затем разбавьте культуру до OD 750, равной 0.003, после чего оберните флакон алюминиевой фольгой для обеспечения гомогенной плотности, так как данный штамм является модальным и проявляет направленное движение в ответ на свет. После корректировки плотности суспензии согласно текстовому протоколу установите небольшую кассету с пробирками, подходящую для дозатора жидкостей, и проведите серию промывок для стерилизации в соответствии с инструкциями производителя, чтобы предотвратить контаминацию. Используя кассету дозатора жидкостей на восемь шприцев, нанесите на сухие прямоугольные планшеты четыре ряда по 96 капель культуры объемом 2 µL каждая.

Осторожно постучите по краю чашки, чтобы все капли слились в тонкий слой жидкости, и немедленно закройте чашки, чтобы предотвратить воздействие света. После высыхания поместите чашки под бактерицидную УФ-лампу на время, определенное эмпирическим путем для получения оптимального выхода мутантов ts среди выживших. Затем перенесите чашки в темное место на период от 8 до 24 часов при комнатной температуре.

Затем поместите чашки в инкубатор при температуре 21 °C с освещением. Примерно через 10 дней, когда колонии вырастут, но еще не сольются, загрузите чашки в соответствующий стек в качестве источников для роботизированного отбора колоний. Затем отберите колонии в массивы 384 на прямоугольных планшетах и культивируйте их при температуре 21 °C с освещением в течение примерно одной недели.

С помощью робота для репликационного посева перенесите содержимое массивов из 384 лунок в массивы по 1536 лунок и инкубируйте планшеты при 21 °C в течение примерно трех дней. Выполните репликацию массивов по 1536 лунок на два планшета каждый: один поместите в инкубатор при 21 °C, а другой — в инкубатор при 33 °C. После 24 часов инкубации при 33 °C перенесите содержимое планшетов из инкубатора при 33 °C на новый набор предварительно прогретых планшетов и поместите их обратно в инкубатор при 33 °C.

После трех дней культивирования при 33 °C и пяти дней культивирования при 21 °C с помощью цифровой камеры сфотографируйте сеточную пластину с девятью метками совмещения. Затем сфотографируйте чашки, чередуя пластины при 21 °C с соответствующими пластинами при 33 °C, разместив все пластины в фиксированной раме для сохранения точной ориентации. Обработайте парные изображения пластин при 21 и 33 °C с помощью специализированного программного обеспечения Matte Lab для анализа изображений, чтобы удалить фон и сегментировать изображения в массив из 1536 элементов.

Программа определит обнаруженную биомассу как общую интенсивность пикселей в каждой позиции. Загрузите список выбранных колоний, созданный программным обеспечением, в качестве файла инструкций для робота по отбору единичных колоний. Затем подготовьте исходный и целевой планшеты в соответствии с инструкциями по работе с роботом и запустите процесс переноса выбранных колоний в массив.

Поместите целевые планшеты в инкубатор при температуре 21 °C примерно на пять дней для выращивания стоковой планшетки. После проведения второго анализа накопления биомассы и репликации 100 блочных планшеток согласно текстовому протоколу, сделайте три копии свежей реплики 100 блочных планшеток. После установки третьей планшетки в робот и споттинга колоний сделайте фотомикрографии области каждого спота на скрининговых планшетках в момент времени ноль, затем поместите планшетки в инкубатор при температуре 33 °C.

Через определенные промежутки времени после извлечения скрининговых планшетов из инкубатора при 33 °C быстро сделайте фотомикрографии, убедившись, что держатель планшета и контроллер предметного столика точно откалиброваны для получения изображений одних и тех же клеток в каждой временной точке. Проанализируйте микроскопические изображения и выберите мутанты в соответствии с заданными критериями. Высейте окончательно отобранный набор на 96-луночный чашку с агаром, следя за тем, чтобы на каждой чашке находились мутанты одного и того же типа спаривания и с одинаковой лекарственной устойчивостью.

Перенесите большое количество колоний из массива на беззотистую среду для индукции гамет в 96-луночные микропланшеты. Инкубируйте планшеты при освещении в течение примерно пяти часов для обеспечения гаметогенеза. Суспендируйте исследуемые штаммы противоположных типов спаривания, несущие альтернативные кассеты резистентности, в пробирки с беззотистой средой для индукции гамет для проведения гаметогенеза.

Смешайте образцы с целевого планшета в объеме смеси для спаривания 20 µL. Примерно через 10 минут пребывания на свету дважды нанесите по пять µL из каждой лунки: один раз на планшет TAP для анализа сцепления и один раз на планшет TAP с добавлением 5 µM паро и 9 µM hygro для анализа комплементации.

После инкубации чашек для теста на комплементацию сделайте две копии каждой чашки для идентификации ts-фенотипа. Проверьте колонии на наличие ts-фенотипа в соответствии с текстовым протоколом. После облучения одиночных клеток Chlamydomonas клеткам дают расти в течение десяти дней при пермиссивной температуре, затем их переносят в массивном формате, как показано здесь.

Полученные планшеты формата 384 объединяются в массив 1536. Для получения термочувствительных (ts) мутантов Chlamydomonas были протестированы три времени УФ-облучения. Эмпирически было установлено, что время облучения 1.5 minute дает наибольшее количество ts-мутантов.

Тем не менее, время экспозиции в одну минуту принесло наибольшее количество кандидатов, связанных с клеточным циклом. В данном эксперименте было проведено два последовательных анализа ts-фенотипа, в результате чего было выделено около 3000 ts-мутантов, которые были фенотипически охарактеризованы с помощью микроскопии в режиме таймлапс. Как показано здесь, для исключения часто повторяющихся генов из последующего этапа анализа проводились тесты на комплементацию и сцепление новых кандидатов с уже охарактеризованными генами, имеющими более двух аллелей.

Эти колонии не проявляют комплементации с исследуемым штаммом и, следовательно, представляют собой новые ts-аллели искомого гена. Как правило, такие колонии исключаются из дальнейшего анализа. После освоения данный метод может быть реализован в высокопроизводительном формате.

Тысячи ts-мутантов могут быть изолированы всего за два или три раунда мутагенеза. Ключевым этапом после изоляции ts-мутантов является выбор подгруппы для дальнейшего изучения, при этом представляет большой интерес анализ спектра летальных фенотипов. Фенотипирование дает подсказки относительно молекулярной функции, а также помогает определить приоритетность мутантов для последующего исследования.

Имейте в виду, что мутанты могут иметь сотни или тысячи мутаций в своих геномах. Обычно только одна из них является причинной, хотя иногда для проявления ts-фенотипа требуются две мутации, что можно определить с помощью тетра-анализа. После выполнения этой процедуры причинные мутации можно идентифицировать путем секвенирования следующего поколения (NGS) объединенных образцов. Идентифицированные гены иногда будут иметь мутации, указывающие на их функцию, либо это могут быть новые, неизвестные последовательности, что представляет особый интерес.

Chlamydomonas является отличной модельной системой для изучения клеточной биологии растений. Описанные вами процедуры должны открыть возможности для исследования этого организма в отношении основных процессов, которые оставались относительно малоизученными, и мы надеемся, что полученные результаты будут применимы и к царству растений в целом.