Высокопроизводительный роботизированная Изоляция термочувствительных Смертельное Мутанты в Chlamydomonas reinhardtii

Общая цель процедуры состоит в том, чтобы использовать робототехнику и стандартизированные анализы для упрощения выделения чувствительных к температуре летальных мутаций у хламидомонов с целью определения основных генов и путей в этом организме. Нас интересует как сохранение, так и дивергенция основных клеточных функций у эукариот. И мы любим изучать это с помощью мутаций, которые нарушают основные гены в этих процессах.

Для того, чтобы это работало хорошо, вам нужна действительно всеобъемлющая коллекция мутантов, и методы, о которых вы услышите, являются нашим способом создания такой коллекции. Мы работаем с зелеными водорослями Chlamydomonas reinhardtii в качестве представителя растительного царства. Основное преимущество этого метода заключается в том, что чувствительные к температуре летальные мутации, вероятно, могут быть обнаружены в каждом важном пути.

Метод не требует предварительных знаний или целенаправленного мутагенеза. Молекулярная функция мутировавшего гена была выявлена непосредственно из летального фенотипа. Это помогает нам отбирать интересные мутации, нарушающие различные пути сиалы, выходящие за рамки контроля клеточного цикла.

Для проведения УФ-мутагенеза культивирования клеток Chlamydomonas с наружным диаметром до 750 от 0,2 до 0,5 в 100 мл трис-ацетат-фосфата, или TAP, под светом при температуре 25 градусов Цельсия и встряхиванием при 100 об/мин. УФ-мутагенез проводится независимо друг от друга в двух генетических фонах согласно текстовому протоколу. Проверьте образец каждой культуры под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки жизнеспособны и не загрязнены.

Затем разбавьте культуру наружным диаметром 750 0,003, затем оберните бутылку алюминиевой фольгой, чтобы обеспечить однородную плотность, так как штамм является модальным и плавает направленно в ответ на свет. После регулировки плотности суспензии согласно текстовому протоколу прикрепите небольшую трубку-кассету, в которую помещается дозатор жидкости, и выполните серию промывок для стерилизации, согласно инструкции производителя, для предотвращения загрязнения. С помощью восьмишприцевого дозатора жидкостей в кассете дозируйте четыре по 96 капель по два микролитра культуры на сухие прямоугольные планшеты.

Осторожно постучите по краю пластины, чтобы обеспечить слияние всех капель в тонкий лист жидкости, и немедленно накройте пластины, чтобы предотвратить попадание света. После высыхания поместите пластины под бактерицидную ультрафиолетовую лампу на периоды времени, определенные опытным путем, чтобы получить оптимальный выход ts-мутантов среди выживших. Далее перенесите пластины в темноту на восемь-24 часа при комнатной температуре.

Затем поместите пластины в инкубатор с температурой 21 градус Цельсия с подсветкой. Примерно через 10 дней, когда колонии будут выращены, но не объединены, загрузите тарелки в соответствующую стопку в качестве источников для роботизированного сбора колоний. Затем выберите колонии для 384 массивов на прямоугольных пластинах и выращивайте их при температуре 21 градус Цельсия с освещением примерно на одну неделю.

Используя робота для нанесения точных покрытий, сконденсируйте массивы 384 в массив 1536 и дайте пластинам расти в инкубаторе с температурой 21 градус Цельсия в течение примерно трех дней. Скопируйте массивы 1536 на две пластины и поместите одну в инкубатор с температурой 21 градус Цельсия, а другую — в инкубатор с температурой 33 градуса Цельсия. Через 24 часа при температуре 33 градуса Цельсия повторите пластины из инкубатора с температурой 33 градуса Цельсия на новый набор предварительно нагретых пластин и поместите их в инкубатор с температурой 33 градуса Цельсия.

После трех дней роста при 33 градусах Цельсия и пяти дней роста при 21 градусе Цельсия используйте цифровую камеру, чтобы сфотографировать сетчатую пластину, отмеченную девятью индикаторами выравнивания. Затем сфотографируйте пластины, чередуя пластины с температурой 21 градус Цельсия, а затем соответствующие пластины с температурой 33 градуса Цельсия, причем все пластины помещены в фиксированную рамку для сохранения точной ориентации. Обрабатывайте сопряженные изображения 21, 33 пластин с помощью специального программного обеспечения для анализа матовых изображений в лаборатории, чтобы удалить фон и разделить изображения на массив 1536.

Программа определит обнаруженную биомассу как общую интенсивность пикселей в каждой позиции. Загрузите список выбранных колоний, сгенерированный программным обеспечением, в виде файла инструкций для робототехники для сбора одиночных колоний. Затем подготовьте исходную и целевую пластины в соответствии с инструкциями робототехники и позвольте роботу выбрать выбранные колонии в массив.

Поместите целевые пластины в инкубатор с температурой 21 градус Цельсия примерно на пять дней, чтобы вырастить пластину для запаса. После проведения повторного анализа накопления биомассы и тиражирования 100 блочных пластин в соответствии с текстовым протоколом, тиражировать свежую копию из 100 блочных пластин до трех копий. После установки третьей пластины в роботе и обнаружения колоний, сделайте микрофотографии области каждого пятна экранирующих пластин при временном нуле и поместите пластины при температуре 33 градуса Цельсия для инкубации.

В различные моменты времени после извлечения экранных планшетов из инкубатора с температурой 33 градуса Цельсия быстро сделайте микрофотографии, убедившись, что держатель планшета и контроллер сцены точно откалиброваны для получения изображений одних и тех же клеток в каждой временной точке. Анализируйте микроскопические изображения и отбирайте мутантов на основе нужных критериев. Найдите окончательный выбранный набор в агаровой пластине из 96 штук, убедившись, что каждая пластина содержит мутантов с одинаковым типом спаривания и устойчивостью к лекарствам.

Перенесите большое количество расположенных колоний в безазотистую среду для индукции гамет на 96 луночных микропланшетах. Инкубируйте планшеты под светом в течение примерно пяти часов, чтобы обеспечить гаметогенез. Приостановите запросы с противоположными типами сопряжения, содержащими альтернативные кассеты сопротивления, в пробирки с индукционной средой для гаметогенеза без азота.

Смешайте образцы с целевой пластины в сопрягаемой смеси объемом 20 микролитров. Примерно через 10 минут под светом дважды засеките пять микролитров из каждой лунки. Один раз на пластине TAP для тестирования рычажного механизма и один раз на TAP плюс пять микромолей paro плюс девять микромолей hygro для тестирования комплементации.

После инкубации планшетов для тестирования комплементации реплицируйте планшеты в две копии для идентификации фенотипа. Тестируйте колонии на ts фенотип согласно текстовому протоколу. После облучения одиночных клеток Chlamydomonas клеткам дают расти в течение десяти дней при допустимой температуре, а затем собирают в упорядоченный формат, как показано здесь.

Полученные пластины в формате 384 объединяются в массив 1536. Было протестировано три времени воздействия ультрафиолета для получения мутантов Chlamydomonas. Опытным путем 1,5-минутное время экспозиции дало наибольшее количество ts-мутантов.

Однако, безусловно, время экспозиции в одну минуту дало большинство кандидатов в клеточный цикл. В этом эксперименте были проведены два последовательных анализа тс-фенотипа, и около 3000 тс-мутантов были выделены и фенотипически охарактеризованы с помощью покадровой микроскопии. Как видно на рисунке, для удаления высокорецидивных генов из нисходящего конвейера были проведены испытания комплементации и сцепления с уже охарактеризованными генами с более чем двумя аллелями в отношении вновь собранных кандидатов.

Эти колонии не демонстрируют комплементации с запросом и, следовательно, являются новыми аллелями ts для запрашиваемого гена. Как правило, они исключаются из дальнейшей характеристики. Как только эта техника будет освоена, ее можно будет выполнять с высокой пропускной способностью.

Тысячи тс-мутантов могут быть выделены всего за два или три раунда мутагенеза. Ключевым шагом после выделения ts-мутантов является выбор подмножества для дальнейшего изучения, и очень интересно увидеть диапазон летальных фенотипов. Фенотипирование дает подсказки о молекулярных функциях, а также помогает нам определить приоритеты мутантов для дальнейшего изучения.

Имейте в виду, что мутанты могут иметь сотни или тысячи мутаций в своих геномах. Обычно только одна из них является причиной, хотя иногда для фенотипа ts требуются две мутации, и это может быть определено с помощью тетра-анализа. После этой процедуры причинные мутации могут быть идентифицированы с помощью анализа секвенирования следующего поколения объединенных генов. Идентифицированные гены иногда будут иметь мутации, предполагающие функцию, или они могут быть новыми, неизвестными последовательностями, что интересно и захватывающе.

Chlamydomonas является потрясающей модельной системой для изучения клеточной биологии в растительном мире. Процедуры, о которых вы слышали, должны открыть изучение этого организма для основных процессов, которые были относительно неизучены, и мы надеемся, что результаты будут также актуальны для более широкого растительного царства.