Срабатывание клеточный стресс и смерть с использованием обычных УФ-лазера конфокальной микроскопии
February 3rd, 2017
Целенаправленные манипуляции, направленные на то, чтобы вызвать направленный стресс или смерть в отдельных клетках, были относительно сложными для выполнения. В данной работе описан подход к абляции с одноклеточным разрешением для селективного стресса и уничтожения отдельных клеток в клеточной культуре и у живых животных, основанный на стандартном конфокальном ультрафиолетовом лазере.
Общая цель этого подхода к клеточной абляции заключается в избирательном стрессе или уничтожении отдельных клеток в клеточной культуре или у живых животных. Этот метод позволяет исследователям изучать судьбу одной умирающей клетки и реакцию клеток, таких как микроглия и астроциты, на окружающий участок абляции. Основным преимуществом этого метода является точное нацеливание на отдельные клетки, а это может быть достигнуто с помощью обычного конфокального микроскопа, оснащенного лазером с яркостью 405 нанометров.
Мы используем рыбок данио в качестве модельной системы для изучения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь двигательных нейронов или лобно-височная деменция. Визуализация гибели двигательного нейрона и последующих последствий дает прекрасную возможность лучше понять динамические процессы, участвующие в заболевании. Наш подход к воздействию клеточного стресса дозозависимым образом позволяет детально охарактеризовать клеточные взаимодействия.
Например, клиренс микроглии после нуэрональной гибели. В то время как этот метод дает представление о механизмах заболевания живого организма, он также может быть применен аналогичным образом к изолированным клеткам в культуре. После установки трансгенных линий самца и самки для спаривания согласно текстовому протоколу, используйте пластиковое ситечко для чая для сбора эмбрионов после успешного нереста путем процеживания воды в аквариуме.
Затем с помощью яичной воды промойте яйца и переложите их в яичную воду в чашке Петри. Рассмотрите эмбрионы под световым микроскопом, чтобы определить оплодотворение. Затем инкубируйте оплодотворенные яйца при температуре 28 градусов по Цельсию.
Когда эмбрионы достигнут двух-пяти дней после оплодотворения или DPF, поместите их под флуоресцентный микроскоп и проверьте эмбрионы на соответствующую экспрессию флуорофора. Затем отделите ярко маркированную рыбу в свежую посуду с яичной водой для последующей закладки. Чтобы поместить рыбок данио в агарозу, приготовьте раствор для анестезии, добавив четыре грамма на литр MS 222 по каплям в чашку Петри, содержащую яичную воду.
Приготовьте бульон из низкоплавкой агарозной и яичной воды и разложите его по микроцентрифужным пробиркам объемом 1,5 миллилитров. Поместите аликвоту в нагревательный блок при температуре от 38 до 40 градусов Цельсия и дайте ему сбалансироваться. Для визуализации продолжительностью более четырех часов нанесите пипеткой примерно 300 микролитров агарозы вдоль внутреннего круга чашки со стеклянным дном, чтобы получить круг в форме пончика с небольшим отверстием в центре.
Чтобы смонтировать данио-рерио в агарозе для микроскопии, после обезболивания рыбы согласно текстовому протоколу, с помощью регулируемой пипетки вытяните личинку и дайте ей опуститься на дно кончика. Опустите личинку в минимальном объеме жидкости в предварительно разогретую агарозу. Затем наберите рыбу с агарозой и быстро разложите ее в заранее подготовленную посуду со стеклянным дном 35 миллиметров.
Под микроскопом для вскрытия используйте стандартную кисть, чтобы расположить животное или нескольких животных внутри агарозы на боках так, чтобы тело и хвост были плоскими. Дайте погруженной рыбе постоять от 10 до 15 минут, пока агароза не застынет. Затем с помощью примерно двух миллилитров яичной воды с трикаином аккуратно долить 35-миллиметровую чашку Петри.
Поместите чашку Петри со встроенной личинкой на предметный столик конфокального микроскопа и, используя яркое освещение поля и 40-кратное увеличение, сфокусируйтесь на дорсальной стороне спинного мозга животного. Переключитесь на соответствующую настройку флуоресценции и визуализируйте интересующую структуру, чтобы убедиться, что все параметры визуализации соответствуют необходимым для последующей абляции. Чтобы определить толщину структуры для УФ-лазерной абляции, используйте Z-привод для проверки верхней и нижней части интересующей структуры, вручную фокусируясь вверх и вниз.
Вручную запишите плоскость Z, которая будет аблицирована. Например, центр клетки. Чтобы провести лазерную абляцию, запустите FRAP Wizard, нажав на выпадающее меню в верхней части меню программного обеспечения.
В новом окне определите параметры изображения для абляции, выбрав формат, скорость сканирования и усреднение. Если плоскость Z для абляции еще не выбрана, нажмите кнопку Live и сфокусируйтесь на образце, пока флуоресцентная структура или желаемая плоскость Z, которую необходимо аблять, не окажутся в фокусе. После настройки общих параметров изображения перейдите на шаг Отбеливатель для управления конкретными компонентами абляции.
Затем задействуйте лазер с яркостью 405 нанометров, активировав его для процедуры отбеливания. Затем используйте опцию «Увеличить масштаб», чтобы максимизировать интенсивность обесцвечивания при выбранной ROI за счет уменьшения поля сканирования, тем самым максимизируя время задержки. Выберите один или несколько значений ROI для абляции с помощью любого из инструментов рисования в окне «Получение изображений».
Например, нацеливайтесь на бугорок аксона с помощью инструмента для кругового рисования размером примерно от четырех до восьми микрометров. После определения ROI нажмите кнопку «Ход времени» и подтвердите количество циклов, в течение которых ROI будут сканироваться и удаляться. Выберите рамки «До и после отбеливания» по желанию, чтобы обеспечить обзор всего изображения непосредственно до и сразу после процесса отбеливания.
Эти настройки позволяют исследователям выполнять несколько уровней уточнения. Благодаря регулировке мощности лазера, скорости сканирования, усреднения линий, размера области интереса и повторений, этот метод обеспечивает высокую степень свободы для создания стресса или смерти в отдельных клетках. После установки всех необходимых параметров абляции нажмите Run Experiment и следите за эффективностью абляции.
Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительной информации. В этом эксперименте была проведена УФ-лазерная абляция GFP, экспрессирующих моторные нейроны в спинном мозге трансгенных рыбок данио. Экспрессия GFP, управляемая промоторами моторных нейронов, такими как 3 MINX one, IO one или MET, позволяет визуализировать с высоким разрешением тела клеток, основные аксоны и периферические ветви, простирающиеся к мышцам.
Успешная абляция нейронов в спинном мозге была достигнута, когда флуоресценция исчезает сразу после абляции и никогда не возобновляется. Специфичность этого подхода подтверждается, как показано здесь, где один целевой нейрон был преобразован с помощью фотоконвертируемого фотофлуро Kaede, который переключает свое излучение с зеленого на красный после воздействия ультрафиолетового света. Для нацеливания на клетки с различной интенсивностью доступно несколько уровней тонкой настройки путем регулировки мощности лазера, скорости сканирования, усреднения линий, величины удаляемой рентабельности инвестиций и повторений.
Как показано на рисунке, моторные нейроны с длинными аксональными проекциями, которые были удалены в соме с более низкой интенсивностью ультрафиолетового лазера, показали характерный блеббинг, который продолжался от сомы вдоль аксона с течением времени. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что каждая конфокальная установка уникальна, и что выходная мощность лазера для каждого инструмента специфична и может отличаться. После процедуры в абляцированных нейронах можно увидеть характерные признаки гибели апоптотических клеток.
Апоптотические маркеры, такие как XN 5, или морфологические изменения, такие как сомальная дегенерация или наружный блеббинг, могут быть воспроизводимо обнаружены. Дополнительные тесты могут быть проведены, чтобы ответить на дальнейшие вопросы, например, как влияет на эффективность плавания абляция одного или нескольких нейронов в спинном мозге. Скрещивая различные трансгенные линии рыбок данио, исследователи могут исследовать реакцию других клеток на разрушение клеток, вызванное лазером.
Эти методы обеспечивают уникальную экспериментальную платформу для понимания точных молекулярных механизмов такого заболевания, как MND in vivo. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить рыбок данио к конфокальной микроскопии и как проводить одноклеточную УФ-лазерную абляцию.
Обзор
В данной статье описывается новая техника абляции с разрешением на уровне отдельной клетки, которая позволяет исследователям селективно стрессировать или убивать отдельные клетки в клеточной культуре и у живых животных. Используя стандартный конфокальный УФ-лазер, этот метод предоставляет представление о клеточных реакциях и взаимодействиях после целенаправленной гибели клеток.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования нейродегенеративных заболеваний
Фон
- Целенаправленная манипуляция отдельными клетками была сложной задачей.
- Понимание клеточных реакций на стресс важно для нейродегенеративных заболеваний.
- Микроглии и астроциты играют значительную роль в реакции на гибель нейронов.
- Дана используются как эффективная модель для изучения этих процессов.
Цель исследования
- Разработать точный метод для индукции стресса или гибели отдельных клеток.
- Изучить судьбу умирающих клеток и окружающих клеточных реакций.
- Улучшить понимание механизмов нейродегенеративных заболеваний.
Использованные методы
- Использование конфокального микроскопа, оснащенного 405 нм лазером для абляции.
- Применение дозового подхода для вызывания клеточного стресса.
- Встраивание личинок данио в агарозу для визуализации и абляции.
- Мониторинг клеточных реакций после абляции с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основные результаты
- Успешная абляция мотонейронов у трансгенных данио.
- Немедленное исчезновение флуоресценции после абляции указывает на эффективное нацеливание.
- Характеристика очистки микроглии после гибели нейронов.
- Взгляд на динамические процессы, участвующие в нейродегенеративных заболеваниях.
Выводы
- Разработанная техника позволяет точное изучение реакций отдельных клеток.
- Этот метод может быть применен как в in vivo, так и в in vitro условиях.
- Дальнейшие исследования могут использовать этот подход для изучения механизмов заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This method enables precise, dose-dependent single-cell ablation using standard confocal microscopy, offering a scalable approach to study cellular stress responses and intercellular signaling in neurodegenerative disease models. By allowing real-time visualization of microglial and astrocytic reactions to targeted neuronal injury, it supports mechanistic de-risking in early target validation and phenotypic screening workflows. The technique enhances predictive confidence in lead identification by providing quantitative, reproducible readouts of cell death kinetics and glial activation in physiologically relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through controlled induction of cellular stress in individual neurons within intact tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for functional target validation using dose- and time-dependent ablation parameters.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking single-cell death outcomes to downstream glial responses relevant to neuroinflammatory pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts of axonal degeneration and cellular fragmentation for assay standardization.
- Operational Value: Facilitates high-content screening readiness through adjustable laser parameters (power, scan speed, ROI size) for consistent stress induction.
- Scalability: Enables platform reuse across cell culture and in vivo zebrafish models without requiring specialized equipment beyond a 405-nm laser-equipped confocal system.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase single-cell ablation observations to preclinical validation of neurodegenerative mechanisms in zebrafish.
- Biomarker Alignment: Supports evaluation of microglial activation and axonal degeneration as translatable biomarkers of neuronal injury.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables mechanistic de-risking by characterizing dose-dependent cell death phenotypes and surrounding cellular responses prior to compound testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven ablation studies that inform target confidence and pathway clarification before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking through precise, reproducible induction of cellular stress to clarify death pathways and glial activation dynamics.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved outputs (e.g., fluorescence loss, blebbing, axonal degeneration) suitable for automated image-based analysis in compound screening.
- Analytics: Provides dose-response and time-course data that allow statistical comparison of ablation conditions and cellular responses across experimental groups.
- Translational Research: Maintains continuity from single-cell injury in zebrafish to phenotypic models of neurodegenerative disease, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across neuroscience discovery teams, adaptable to various cell types and disease models using standard confocal infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in cell-specific death mechanisms and glial responses.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through laser parameter control and compatibility with conventional confocal microscopes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by enabling early assessment of target engagement via phenotypic readouts of neuronal death and neuroinflammation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating mechanistic data on dose-dependent cell death and downstream cellular interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, zebrafish handling, and fluorescence-based ablation parameter optimization.
- Dependent on access to a confocal microscope equipped with a 405-nm laser and appropriate filter sets for UV excitation and emission detection.
- Necessitates standardization of laser power, scan speed, ROI size, and repetition counts across users and sessions for reproducible ablation outcomes.
- Requires adaptation of embedding and imaging protocols when applying the method to different model systems (e.g., cell culture vs. intact organisms).
- Practical limitations include potential phototoxicity beyond the targeted ROI and variability in laser output between confocal systems, necessitating per-instrument calibration.
