Срабатывание клеточный стресс и смерть с использованием обычных УФ-лазера конфокальной микроскопии
3 февраля 2017 г.
Целенаправленные манипуляции, направленные на то, чтобы вызвать направленный стресс или смерть в отдельных клетках, были относительно сложными для выполнения. В данной работе описан подход к абляции с одноклеточным разрешением для селективного стресса и уничтожения отдельных клеток в клеточной культуре и у живых животных, основанный на стандартном конфокальном ультрафиолетовом лазере.
Общая цель этого подхода к клеточной абляции заключается в избирательном стрессе или уничтожении отдельных клеток в клеточной культуре или у живых животных. Этот метод позволяет исследователям изучать судьбу одной умирающей клетки и реакцию клеток, таких как микроглия и астроциты, на окружающий участок абляции. Основным преимуществом этого метода является точное нацеливание на отдельные клетки, а это может быть достигнуто с помощью обычного конфокального микроскопа, оснащенного лазером с яркостью 405 нанометров.
Мы используем рыбок данио в качестве модельной системы для изучения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь двигательных нейронов или лобно-височная деменция. Визуализация гибели двигательного нейрона и последующих последствий дает прекрасную возможность лучше понять динамические процессы, участвующие в заболевании. Наш подход к воздействию клеточного стресса дозозависимым образом позволяет детально охарактеризовать клеточные взаимодействия.
Например, клиренс микроглии после нуэрональной гибели. В то время как этот метод дает представление о механизмах заболевания живого организма, он также может быть применен аналогичным образом к изолированным клеткам в культуре. После установки трансгенных линий самца и самки для спаривания согласно текстовому протоколу, используйте пластиковое ситечко для чая для сбора эмбрионов после успешного нереста путем процеживания воды в аквариуме.
Затем с помощью яичной воды промойте яйца и переложите их в яичную воду в чашке Петри. Рассмотрите эмбрионы под световым микроскопом, чтобы определить оплодотворение. Затем инкубируйте оплодотворенные яйца при температуре 28 градусов по Цельсию.
Когда эмбрионы достигнут двух-пяти дней после оплодотворения или DPF, поместите их под флуоресцентный микроскоп и проверьте эмбрионы на соответствующую экспрессию флуорофора. Затем отделите ярко маркированную рыбу в свежую посуду с яичной водой для последующей закладки. Чтобы поместить рыбок данио в агарозу, приготовьте раствор для анестезии, добавив четыре грамма на литр MS 222 по каплям в чашку Петри, содержащую яичную воду.
Приготовьте бульон из низкоплавкой агарозной и яичной воды и разложите его по микроцентрифужным пробиркам объемом 1,5 миллилитров. Поместите аликвоту в нагревательный блок при температуре от 38 до 40 градусов Цельсия и дайте ему сбалансироваться. Для визуализации продолжительностью более четырех часов нанесите пипеткой примерно 300 микролитров агарозы вдоль внутреннего круга чашки со стеклянным дном, чтобы получить круг в форме пончика с небольшим отверстием в центре.
Чтобы смонтировать данио-рерио в агарозе для микроскопии, после обезболивания рыбы согласно текстовому протоколу, с помощью регулируемой пипетки вытяните личинку и дайте ей опуститься на дно кончика. Опустите личинку в минимальном объеме жидкости в предварительно разогретую агарозу. Затем наберите рыбу с агарозой и быстро разложите ее в заранее подготовленную посуду со стеклянным дном 35 миллиметров.
Под микроскопом для вскрытия используйте стандартную кисть, чтобы расположить животное или нескольких животных внутри агарозы на боках так, чтобы тело и хвост были плоскими. Дайте погруженной рыбе постоять от 10 до 15 минут, пока агароза не застынет. Затем с помощью примерно двух миллилитров яичной воды с трикаином аккуратно долить 35-миллиметровую чашку Петри.
Поместите чашку Петри со встроенной личинкой на предметный столик конфокального микроскопа и, используя яркое освещение поля и 40-кратное увеличение, сфокусируйтесь на дорсальной стороне спинного мозга животного. Переключитесь на соответствующую настройку флуоресценции и визуализируйте интересующую структуру, чтобы убедиться, что все параметры визуализации соответствуют необходимым для последующей абляции. Чтобы определить толщину структуры для УФ-лазерной абляции, используйте Z-привод для проверки верхней и нижней части интересующей структуры, вручную фокусируясь вверх и вниз.
Вручную запишите плоскость Z, которая будет аблицирована. Например, центр клетки. Чтобы провести лазерную абляцию, запустите FRAP Wizard, нажав на выпадающее меню в верхней части меню программного обеспечения.
В новом окне определите параметры изображения для абляции, выбрав формат, скорость сканирования и усреднение. Если плоскость Z для абляции еще не выбрана, нажмите кнопку Live и сфокусируйтесь на образце, пока флуоресцентная структура или желаемая плоскость Z, которую необходимо аблять, не окажутся в фокусе. После настройки общих параметров изображения перейдите на шаг Отбеливатель для управления конкретными компонентами абляции.
Затем задействуйте лазер с яркостью 405 нанометров, активировав его для процедуры отбеливания. Затем используйте опцию «Увеличить масштаб», чтобы максимизировать интенсивность обесцвечивания при выбранной ROI за счет уменьшения поля сканирования, тем самым максимизируя время задержки. Выберите один или несколько значений ROI для абляции с помощью любого из инструментов рисования в окне «Получение изображений».
Например, нацеливайтесь на бугорок аксона с помощью инструмента для кругового рисования размером примерно от четырех до восьми микрометров. После определения ROI нажмите кнопку «Ход времени» и подтвердите количество циклов, в течение которых ROI будут сканироваться и удаляться. Выберите рамки «До и после отбеливания» по желанию, чтобы обеспечить обзор всего изображения непосредственно до и сразу после процесса отбеливания.
Эти настройки позволяют исследователям выполнять несколько уровней уточнения. Благодаря регулировке мощности лазера, скорости сканирования, усреднения линий, размера области интереса и повторений, этот метод обеспечивает высокую степень свободы для создания стресса или смерти в отдельных клетках. После установки всех необходимых параметров абляции нажмите Run Experiment и следите за эффективностью абляции.
Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительной информации. В этом эксперименте была проведена УФ-лазерная абляция GFP, экспрессирующих моторные нейроны в спинном мозге трансгенных рыбок данио. Экспрессия GFP, управляемая промоторами моторных нейронов, такими как 3 MINX one, IO one или MET, позволяет визуализировать с высоким разрешением тела клеток, основные аксоны и периферические ветви, простирающиеся к мышцам.
Успешная абляция нейронов в спинном мозге была достигнута, когда флуоресценция исчезает сразу после абляции и никогда не возобновляется. Специфичность этого подхода подтверждается, как показано здесь, где один целевой нейрон был преобразован с помощью фотоконвертируемого фотофлуро Kaede, который переключает свое излучение с зеленого на красный после воздействия ультрафиолетового света. Для нацеливания на клетки с различной интенсивностью доступно несколько уровней тонкой настройки путем регулировки мощности лазера, скорости сканирования, усреднения линий, величины удаляемой рентабельности инвестиций и повторений.
Как показано на рисунке, моторные нейроны с длинными аксональными проекциями, которые были удалены в соме с более низкой интенсивностью ультрафиолетового лазера, показали характерный блеббинг, который продолжался от сомы вдоль аксона с течением времени. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что каждая конфокальная установка уникальна, и что выходная мощность лазера для каждого инструмента специфична и может отличаться. После процедуры в абляцированных нейронах можно увидеть характерные признаки гибели апоптотических клеток.
Апоптотические маркеры, такие как XN 5, или морфологические изменения, такие как сомальная дегенерация или наружный блеббинг, могут быть воспроизводимо обнаружены. Дополнительные тесты могут быть проведены, чтобы ответить на дальнейшие вопросы, например, как влияет на эффективность плавания абляция одного или нескольких нейронов в спинном мозге. Скрещивая различные трансгенные линии рыбок данио, исследователи могут исследовать реакцию других клеток на разрушение клеток, вызванное лазером.
Эти методы обеспечивают уникальную экспериментальную платформу для понимания точных молекулярных механизмов такого заболевания, как MND in vivo. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить рыбок данио к конфокальной микроскопии и как проводить одноклеточную УФ-лазерную абляцию.
Обзор
В данной статье описывается новый метод абляции с разрешением до одной клетки, который позволяет исследователям избирательно подвергать стрессу или уничтожать отдельные клетки в клеточных культурах и в живых животных. Используя стандартный конфокальный УФ-лазер, этот метод позволяет изучить клеточные ответы и взаимодействия, возникающие после направленной гибели клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Исследование нейродегенеративных заболеваний
Теоретические основы
- Направленное манипулирование отдельными клетками представляло собой сложную задачу.
- Понимание клеточного ответа на стресс имеет решающее значение при нейродегенеративных заболеваниях.
- Микроглия и астроциты играют важную роль в ответ на гибель нейронов.
- Zebrafish служат эффективной моделью для изучения этих процессов.
Цель исследования
- Разработать точный метод индуцирования стресса или гибели отдельных клеток.
- Изучить судьбу погибающих клеток и клеточные реакции в их окружении.
- Углубить понимание механизмов нейродегенеративных заболеваний.
Используемые методы
- Использование конфокального микроскопа, оснащенного лазером с длиной волны 405 nm, для проведения абляции.
- Применение дозозависимого подхода для индукции клеточного стресса.
- Помещение личинок zebrafish в агарозу для визуализации и абляции.
- Мониторинг клеточных ответов после абляции с помощью флуоресцентной микроскопии.
Основные результаты
- Успешная абляция мотонейронов у трансгенных данио-рерио.
- Мгновенное исчезновение флуоресценции после абляции свидетельствует об эффективности таргетирования.
- Характеристика клиренса микроглии после гибели нейронов.
- Данные о динамических процессах, вовлеченных в развитие нейродегенеративных заболеваний.
Выводы
- Разработанный метод обеспечивает высокую точность при изучении ответов отдельных клеток.
- Данный метод может быть применен как в условиях in vivo, так и in vitro.
- Дальнейшие исследования могут использовать этот подход для изучения механизмов заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет осуществлять точную дозозависимую абляцию отдельных клеток с помощью стандартной конфокальной микроскопии, предлагая масштабируемый подход к изучению клеточных стрессовых ответов и межклеточной сигнализации в моделях нейродегенеративных заболеваний. Обеспечивая визуализацию в реальном времени реакций микроглии и астроцитов на направленное повреждение нейронов, этот метод способствует механистическому снижению рисков на этапах ранней валидации мишеней и в рабочих процессах фенотипического скрининга. Данная техника повышает прогностическую достоверность идентификации перспективных соединений-лидеров, предоставляя количественные и воспроизводимые данные о кинетике гибели клеток и активации глии в физиологически релевантных системах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы посредством контролируемой индукции клеточного стресса в отдельных нейронах внутри интактной ткани.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимую платформу для функциональной валидации мишеней с использованием дозо- и времязависимых параметров абляции.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов путем установления связи между гибелью отдельных клеток и последующими глиальными ответами, имеющими значение для нейровоспалительных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные на основе флуоресценции о дегенерации аксонов и фрагментации клеток для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: обеспечивает готовность к высокопроизводительному скринингу с анализом содержания за счет регулируемых параметров лазера (мощность, скорость сканирования, размер ROI) для обеспечения стабильной индукции стресса.
- Масштабируемость: позволяет повторно использовать платформу для культур клеток и моделей zebrafish in vivo, не требуя специализированного оборудования, помимо конфокальной системы, оснащенной лазером с длиной волны 405 nm.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Связывает результаты наблюдений за абляцией отдельных клеток на этапе поиска с доклинической валидацией механизмов нейродегенерации у zebrafish.
- Согласование биомаркеров: Служит основой для оценки активации микроглии и аксональной дегенерации в качестве транслируемых биомаркеров повреждения нейронов.
- Прогресс с учетом рисков: Позволяет снизить механистические риски путем характеристики дозозависимых фенотипов гибели клеток и окружающих клеточных ответов перед тестированием соединений.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска новых лекарств, позволяя проводить гипотезо-ориентированные исследования по абляции, которые помогают подтвердить уверенность в выборе мишени и уточнить сигнальные пути до начала оптимизации ведущих соединений.
- Открытие в биологии: Обеспечивает снижение механистических рисков за счет точной, воспроизводимой индукции клеточного стресса для выяснения путей гибели и динамики активации глии.
- Скрининг: Предоставляет количественные данные с временным разрешением (например, потеря флуоресценции, блеббинг, аксональная дегенерация), подходящие для автоматизированного анализа изображений при скрининге соединений.
- Аналитика: Предоставляет данные о зависимости «доза-эффект» и временном ходе процесса, что позволяет проводить статистическое сравнение условий абляции и клеточных ответов в различных экспериментальных группах.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность от повреждения единичных клеток у zebrafish до фенотипических моделей нейродегенеративных заболеваний, поддерживая валидацию мишеней на основе биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Служит многократно используемым инструментом для исследовательских групп в области нейронаук, адаптируемым к различным типам клеток и моделям заболеваний с использованием стандартной инфраструктуры конфокальной микроскопии.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишени за счет снижения неопределенности в механизмах гибели специфических типов клеток и реакциях глии.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря контролю параметров лазера и совместимости с обычными конфокальными микроскопами.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), позволяя проводить раннюю оценку взаимодействия с мишенью по фенотипическим показателям гибели нейронов и нейровоспаления.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков за счет получения механистических данных о дозозависимой гибели клеток и последующих клеточных взаимодействиях.
Особенности внедрения
- Требуется опыт работы с конфокальной микроскопией, навыками обращения с zebrafish и оптимизацией параметров флуоресцентной абляции.
- Необходим доступ к конфокальному микроскопу, оснащенному лазером с длиной волны 405-nm и соответствующими наборами фильтров для УФ-возбуждения и детектирования эмиссии.
- Для обеспечения воспроизводимости результатов абляции необходима стандартизация мощности лазера, скорости сканирования, размера ROI и количества повторений для всех пользователей и сеансов.
- При применении метода к различным модельным системам (например, к клеточным культурам в сравнении с целыми организмами) требуется адаптация протоколов заливки и визуализации.
- Практические ограничения включают потенциальную фототоксичность за пределами целевого ROI и вариативность выходной мощности лазера между различными конфокальными системами, что требует калибровки для каждого отдельного прибора.
