Профилирование экспрессии с помощью микрочипов

ДНК-микрочипы являются широко используемыми инструментами для одновременного измерения экспрессии множества различных генов. Они состоят из тысяч зондов, каждый из которых представляет отдельный ген, обездвиженных на «чипах» или предметных стеклах, и полагаются на комплементарную гибридизацию для оценки экспрессии генов в различных биологических условиях.

В этом видео будут рассмотрены основные принципы технологии микрочипов, протокол профилирования экспрессии генов с использованием микрочипов и некоторые современные приложения.

Давайте начнем с обсуждения принципов профилирования экспрессии генов и технологии микрочипов.

Одним из самых ранних методов, разработанных для оценки экспрессии генов в биологических образцах, является синдром Нортерн-блоттинга, который включает в себя «зондирование» конкретных молекул РНК, иммобилизованных на мембранах. «Свободно плавающие» зонды распознают комплементарные последовательности РНК в образце и обычно помечены радиоактивными или флуоресцентными молекулами, чтобы их можно было визуализировать.

Достижения в области микропроизводства, секвенирования генома и других технологий привели к разработке микрочипового биочипа. Как и синдром Нортерна, микрочипы основаны на принципе комплементарного связывания между зондом и последовательностями нуклеиновых кислот образца. Однако, в отличие от Northern, в микрочипах олигонуклеотидные зонды иммобилизованы на предметном стекле или чипе. «Свободно плавающие» образцы генерируются из РНК, выделенной из клеток или организмов, представляющих интерес, которая обратно транскрибируется в комплементарную или «с»-ДНК. Они могут быть либо непосредственно помечены флуоресцентными молекулами, либо их количество может быть дополнительно амплифицировано транскрипцией in vitro. Затем образец гибридизуется с чипом. Поскольку зонды на микрочипах, предназначенные для различных применений, могут быть либо «сенсорными», что означает, что их последовательности находятся в том же направлении, что и экспрессируемая РНК организма, либо «антисмысловыми», исследователи должны убедиться, что направленность нити образца дополняет направленность зондов.

«Необработанные» данные об интенсивности флуоресценции для каждой ген-специфичной точки на чипе затем могут быть количественно оценены и обработаны. Данные могут быть подвергнуты дальнейшим статистическим тестам, таким как t-критерий Стьюдента, чтобы определить, существенно ли различаются сигналы флуоресценции и, следовательно, уровни экспрессии для интересующего гена между двумя типами клеток или экспериментальными условиями.

Исследователи также могут использовать эти данные для «кластеризации» или группировки генов на основе схожих паттернов экспрессии. Например, при сравнении паттернов экспрессии между двумя клеточными популяциями может быть обнаружено, что определенные гены демонстрируют изменения экспрессии примерно на эквивалентные величины в одном и том же направлении и, таким образом, будут сгруппированы вместе. Исследователи могут изобразить эти отношения в виде древовидной диаграммы или «древовидной диаграммы», где высота и расположение «ветвей» указывают на то, насколько похожи или непохожи паттерны экспрессии генов. Этот тип анализа может дать представление о генных сетях, поскольку «кластеризованные» гены могут участвовать в одних и тех же биологических путях.

Теперь, когда мы обсудили принципы методологии микрочипов, давайте рассмотрим типичный эксперимент с микрочипами.

Чтобы обеспечить качество выделенной РНК, рабочие места и оборудование должны быть обработаны химическими веществами, которые инактивируют РНКазы — ферменты, которые в противном случае разрушили бы РНК. Затем РНК выделяют из интересующих образцов и очищают, а ее концентрацию и целостность определяют с помощью спектрофотометрии.

Этот образец РНК преобразуется в кДНК, а затем в кРНК. Затем образец мечут флуоресцентными молекулами и фрагментируют, после чего можно снова проверить его качество и количество, после чего также можно оценить степень флуоресцентного мечения.

Затем меченую кРНК смешивают с «раствором для гибридизации» перед загрузкой на микрочип. Чтобы облегчить успешную гибридизацию, на чип помещают «смеситель» для формирования «камер для гибридизации». Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха, так как они могут помешать связыванию образца с определенными областями микрочипа и привести к ложноотрицательному сигналу. После добавления образца чипсы инкубируются при соответствующей температуре в течение 24 часов.

После гибридизации смеситель извлекается из чипа, несвязанный образец смывается, а массив тщательно высушивается центрифугированием в специализированной центрифуге с удержанием стекла. Высушенный чип вставляется в сканер микрочипов, и машина настраивается таким образом, чтобы самые яркие сигналы, наблюдаемые на чипе, не были перенасыщены. Затем микрочип сканируется, и создается изображение всего чипа.

После сканирования чипа файл изображения загружается в программное обеспечение для извлечения данных и оценивается на предмет неоднородностей сигнала. Данные, извлеченные из изображения микрочипа, подвергаются ряду статистических манипуляций, включая логарифмическое преобразование₂, которое позволяет исследователям численно отображать данные с точки зрения кратного увеличения или уменьшения экспрессии генов; а также нормализация, которая учитывает различия сигналов между микрочипами. Эти обработанные данные затем могут быть дополнительно проанализированы.

Теперь, когда мы продемонстрировали, как выполняется профилирование экспрессии с помощью микрочипов, давайте рассмотрим, как микрочипы могут быть использованы в конкретных экспериментах.

Исследователи часто используют микрочипы для оценки того, как экспрессия генов изменяется на протяжении всего биологического процесса, такого как клеточная дифференцировка. Здесь ученые оценили уровни микроРНК, которые представляют собой 22-нуклеотидные малые РНК, участвующие в тонкой настройке экспрессии генов, в трех типах клеток человека, представляющих разные стадии развития сетчатки. Сравнивая экспрессию микроРНК между этими клетками, исследователи смогли идентифицировать гены, потенциально участвующие в дифференцировке и развитии тканей сетчатки.

Микрочипы также могут использоваться для оценки различий в экспрессии между различными клетками или типами тканей. В этом эксперименте была создана модель посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) у грызунов путем воздействия на крыс электрошока. Нейроны были собраны из разных областей мозга и выделена РНК. Затем микрочипы были использованы для идентификации дифференциальной экспрессии генов, связанных с митохондриями в этих нейронах, что дало представление о сложных молекулярных механизмах, лежащих в основе ПТСР.

Наконец, исследователи также применяют микрочипы для изучения рака в надежде на то, что можно будет идентифицировать новые биомаркеры заболеваний. В результате заражения вирусами на протяжении всей нашей эволюции геномы человека содержат вирусные генетические последовательности, называемые «эндогенными ретровирусами» или ERV, некоторые из которых до сих пор активно экспрессируются. Здесь экспрессия ERV в раковых и нормальных тканях предстательной железы сравнивалась с помощью микрочипов. Этот метод позволил исследователям точно определить несколько ERV, которые были повышены при раке предстательной железы, что сделало их потенциальными биомаркерами, которые могут быть использованы для диагностики заболевания.

Вы только что посмотрели видео JoVE о профилировании экспрессии генов с помощью микрочипов. В этом видео были рассмотрены основные принципы технологии микрочипов, протокол профилирования экспрессии и применение этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр!