РНК-секвенирование

Секвенирование РНК, или РНК-секвенирование, — это метод, который может предоставить информацию о последовательности и количестве каждой экспрессируемой РНК, известной как «транскриптом», в клеточной популяции. В отличие от других методов профилирования экспрессии, таких как микрочипы, которые включают в себя зондирование известных последовательностей РНК, RNA-seq может профилировать экспрессию генов организмов с несеквенированными геномами. Кроме того, РНК-секвенирование может точно измерять больший диапазон уровней экспрессии транскриптов, чем микрочипы, особенно при очень низких или очень высоких уровнях.

В этом видео мы расскажем о принципах работы РНК-секвенирования, протоколе подготовки библиотеки РНК-секвенирования и анализа данных, а также о некоторых применениях этой техники.

Во-первых, давайте рассмотрим некоторые принципы, лежащие в основе РНК-секвенирования. Секвенирование транскриптома требует выделения популяции транскриптов, уровни которых необходимо измерить. Большая часть РНК в клетках — это рибосомная РНК, или рРНК, центральный компонент клеточного механизма производства белка. Чтобы облегчить восстановление других типов транскриптов, рРНК обычно удаляют перед секвенированием путем гибридизации образца с комплементарными олигонуклеотидами, прикрепленными к магнитным шарикам, и с помощью магнита для отделения рРНК от остальной части образца.

В качестве альтернативы для секвенирования может быть выбрана конкретная популяция РНК. Например, кодирующие белки матричные РНК, или мРНК, могут быть захвачены с помощью «олиго-dT» — коротких участков дезокси-Т нуклеотидов, которые связываются с последовательностью оснований А, известной как поли-А хвост на конце этих транскриптов. Затем загрязняющая рРНК удаляется. МикроРНК, которые являются 22-нуклеотидными регуляторными РНК, могут быть селективно выделены для секвенирования в зависимости от их размера. Поскольку РНК по своей природе склонна к деградации, она сначала подвергается обратной транскрибации в двухцепочечную ДНК.

Олигонуклеотидные последовательности, известные как адаптеры, затем лигируются на фрагменты ДНК. Адаптеры содержат константные области, которые служат сайтами связывания праймеров для последующей амплификации ПЦР, и они обычно асимметричны, чтобы сохранить «многоцепочность» матрицы. Адаптеры также содержат уникальные последовательности, известные как «штрих-коды», которые идентифицируют все фрагменты, происходящие из одного образца. Затем библиотека амплифицируется с помощью ПЦР.

Секвенирующий чип, на котором имеются олигонуклеотиды, комплементарные адапторам, используется для иммобилизации библиотечного образца, который разбавляется таким образом, что молекулы ДНК отжигаются на чипе с низкой плотностью. ДНК амплифицируется на чипе с помощью процесса, называемого «амплификацией моста» с образованием «клональных кластеров». Короткие фрагменты, каждый длиной 30-150 оснований, затем синтезируются из одного или обоих концов этих матриц ДНК, создавая сотни миллионов продуктов, известных как чтения секвенирования.

Затем результаты секвенирования анализируются на качество, и данные обрабатываются. Анализ последовательностей может выявить широкий спектр информации, включая различия в уровнях экспрессии РНК между образцами и ранее неизвестными транскриптами или формами транскриптов.

Теперь, когда мы рассмотрели, как работает RNA-seq, давайте рассмотрим протокол подготовки библиотеки RNA-seq и анализа данных последовательностей. Сначала из интересующего образца получают РНК, а ее качество проверяют с помощью электрофореза, например, с помощью микрофлюидного устройства, называемого биоанализатором. РНК должна быть высокого качества для получения точных результатов секвенирования. Чтобы убедиться в отсутствии загрязнения ДНК, ОТ-ПЦР для экспрессированного гена проводят с обратной транскриптазой или без нее. Не должно быть продуктов при отсутствии обратной транскриптазы.

Чтобы выбрать поли-А РНК, образцы связывают с олиго-dT-зондами, прикрепленными к магнитным шарикам. Выбранная РНК фрагментируется на 200 нуклеотидных кусочков при высокой температуре в присутствии ионов магния, уменьшая зависящие от длины смещения в последующих реакциях и анализах. Затем фрагменты преобразуются в двухцепочечную ДНК, а адаптеры лигируются. Библиотека амплифицируется методом ПЦР, а ее качество проверяется на биоанализаторе и путем проведения количественной ПЦР. Результаты биоанализа должны выявить пик продуктов при ожидаемом размере, основанном на среднем размере фрагментов и длине адаптеров.

Библиотеки из различных образцов, содержащие различные адаптеры со штрих-кодами, могут быть смешаны вместе с образцом референсной ДНК, добавленным в низкой концентрации в качестве контроля качества для последующих этапов процесса, таких как генерация клональных кластеров и реакции секвенирования. Смесь добавляется в чип для секвенирования и загружается в машину.

Во время реакции секвенирования контролируется плотность кластеров ДНК: она не должна быть слишком высокой, что может привести к перекрестному загрязнению, или слишком низкой, что может привести к недостаточности данных. Качество секвенирования оценивается оценкой Q, которая указывает на вероятность выявления неправильного основания. Q баллов для большинства оснований должен быть больше 30, что соответствует вероятности неправильного чтения менее 1 к 1000. Восстановление референсных последовательностей ДНК с ожидаемой скоростью указывает на то, что все библиотечные последовательности представлены равномерно.

Прочтения, полученные с помощью секвенирования, затем накладываются друг на друга, чтобы вывести РНК, которая была секвенирована. Для организмов с доступной информацией о геноме чтения могут быть выровнены по референсному геному. Количество прочтений на транскриптов подсчитывается для измерения распространенности каждой РНК.

После того, как мы рассмотрим, как работает РНК-секвенирование, давайте рассмотрим некоторые способы его использования.

Секвенирование транскриптома позволяет идентифицировать гены, которые дифференциально экспрессируются в различных условиях. Например, в этом эксперименте сравнивались транскриптомы личинок комаров, полученных в разных условиях роста. Несмотря на то, что этот конкретный вид комаров-переносчиков болезней не имеет секвенированного генома, исследователи смогли сравнить полученную информацию о транскриптоме с другими секвенированными видами и выявить гены с повышенным или пониженным уровнем экспрессии.

РНК-секвенирование также может быть использовано в «массивно-параллельных репортерных анализах» для изучения механизмов регуляции генов. Это делается путем трансфекции клеток млекопитающих библиотекой из тысяч плазмид, каждая из которых содержит мутировавший вариант регуляторного участка гена, «управляя» транскрипцией репортерной последовательности, связанной с уникальными метками. После выделения РНК и высокопроизводительного секвенирования уровни каждой метки оцениваются для оценки экспрессии репортеров из каждой конструкции, что дает представление о функциональной важности нуклеотидов, мутировавших в каждом варианте регуляторного сайта.

Наконец, секвенирование РНК может быть адаптировано для изучения РНК-белковых взаимодействий, в частности, для идентификации транскриптов, с которыми связывается представляющий интерес белок. Белок иммунопреципитируется антителами, а связанные РНК определяются с помощью секвенирования. Если комплексы РНК-белок сшиты в самом начале, анализ секвенирования может составить карту участка сшивки и идентифицировать сайт связывания белка на РНК вплоть до уровня нуклеотидов.

Вы только что посмотрели видео JoVE о RNA-seq. В этом видео мы рассмотрели, как образцы РНК преобразуются в библиотеки, секвенируются и анализируются полученные данные, а также какие типы информации может предоставить анализ секвенирования. Благодаря своей чувствительности, потенциалу для использования в любом организме и сниженной стоимости секвенирования, РНК-секвенирование все чаще используется во многих областях генетических исследований и позволит получить представление о многих вопросах, связанных с функционированием и развитием клеток. Спасибо за просмотр!