Анализ метилирования ДНК
Метилирование ДНК — это химическая модификация ДНК, которая влияет на экспрессию генов в различных клеточных контекстах. Многих исследователей интересует механизм и функции этого процесса, поскольку аберрантное метилирование ДНК связано с такими заболеваниями, как рак.
В этом видео мы расскажем о принципах метилирования ДНК и методах его обнаружения. Затем мы рассмотрим общий протокол для одного из этих методов, анализ бисульфитов и некоторые применения этого метода.
Во-первых, давайте рассмотрим, что такое метилирование ДНК и как его можно обнаружить.
Во время этого биохимического процесса клетка добавляет химическую метку, известную как метильная группа, к основаниям цитозина в своей ДНК. Большинство метилированных цитозинов находятся рядом с основаниями гуанина в одной и той же цепи ДНК, и эти соседние нуклеотиды — и связывающая их фосфодиэфирная связь — называются «CpG». Хотя большинство CpG позвоночных метилированы, те, которые не метилированы, как правило, находятся близко друг к другу в «островках» CpG рядом с промоторами активно экспрессируемых генов. и различные другие элементы регуляторной последовательности.
Вопрос о том, как изменения в метилировании ДНК влияют на регуляцию генов, до сих пор является предметом интенсивных исследований. Метилирование CpG-островов, по-видимому, важно для стабильного, долгосрочного подавления экспрессии генов, наблюдаемого в эпигенетических процессах, таких как геномный импринтинг, который является специфической экспрессией определенных генов, а также инактивация Х-хромосомы, подавление одной из двух Х-хромосом в каждой клетке самок млекопитающих. Также было показано, что подавление критических генов из-за аберрантного метилирования островов CpG способствует неконтролируемому росту клеток, что может привести к раку. Механически метилирование ДНК может способствовать сайленсингу генов, либо предотвращая ассоциацию факторов транскрипции с промоторами, либо привлекая белки, которые модифицируют гистоны и ремоделируют хроматин в транскрипционно непермиссивное состояние.
Существует несколько методов определения состояния метилирования ДНК.
Один из методов, анализ HELP, включает в себя две эндонуклеазы рестрикции, называемые HpaII и MspI, которые соответственно расщепляют только неметилированные или одновременно метилированные и неметилированные последовательности CCGG. Сравнивая паттерны пищеварения, производимые этими двумя ферментами, можно сделать вывод о статусе метилирования ДНК.
Другой метод, называемый иммунопреципитацией метилированной ДНК или «MeDIP», использует антитела, которые связываются с метилированными цитозинами для обогащения метилированных последовательностей ДНК.
Наконец, анализ бисульфитов используется для того, чтобы отличить метилированный цитозин от неметилированного цитозина в ДНК, путем проведения химической реакции, которая превращает неметилированный цитозин в урацил. После этой конверсии обработанная бисульфитом ДНК может быть подвергнута ПЦР, секвенирована и сравнена с референсным геномом. Неметилированные цитозины — это те, которые присутствуют в референсе, но заменены на тимины после анализа бисульфита и ПЦР. Подвергая обработанную бисульфитом ДНК масс-спектрометрии, исследователи также могут создавать «эпиграммы метилирования», которые линейно представляют различные CpG в геноме и отображают степень метилирования в каждой из них. Такие эпиграммы особенно полезны, если исследователи хотят сравнить паттерны метилирования между различными типами клеток.
Давайте теперь подробно рассмотрим протокол для анализа бисульфитов.
Для начала гидроксид натрия добавляют к препаратам геномной ДНК, которые затем инкубируют при температуре 95°C. Это денатурирует ДНК и делает ее основания доступными для последующих химических реакций. Затем метабисульфит натрия вводится в смесь денатурированной ДНК, и происходит два этапа химической реакции. На первом этапе, сульфонировании, сульфитная группа добавляется к неметилированному цитозину с образованием цитозинсульфоната. Затем, во время гидрологического дезаминирования, аминогруппа удаляется из цитозина сульфоната с образованием урацилсульфоната.
Чтобы облегчить эти первые стадии химической реакции, препарат ДНК покрывают минеральным маслом, которое предотвращает испарение и помогает поддерживать концентрацию метабисульфита натрия. Затем реакцию инкубируют при температуре 55°C в темноте. На этом этапе в смесь также добавляется средство для предотвращения окисления, такое как хинол.
Для сбора модифицированной ДНК, содержащей сульфонат урацила и не содержащей минерального масла, смесь центрифугируют и восстанавливают самый нижний слой жидкости. Затем ДНК в этом растворе очищается.
Затем в смесь ДНК добавляют гидроксид натрия, который затем инкубируют при 37°C. Это делается для того, чтобы вызвать десульфонирование, которое, как вы, возможно, уже догадались, удаляет сульфитную группу из сульфоната урацила, образуя урацил и завершая химическую реакцию.
Наконец, смесь нейтрализуется с добавлением ацетата аммония, а ДНК собирается путем осаждения этанола. После того, как бисульфит-преобразованная ДНК была очищена, она подвергается ПЦР и секвенированию.
Теперь, когда мы обсудили основную технику анализа бисульфитов, давайте рассмотрим некоторые экспериментальные приложения.
Некоторые исследователи используют бисульфитный анализ для изучения геномного импринтинга. Здесь исследователи скрестили две разновидности Arabidopsis с генетическими различиями, чтобы можно было различить материнскую и отцовскую ДНК. Затем сравнивались паттерны метилирования в полученных эмбрионах и связанном с ним эндосперме или ткани, которая поддерживает эмбрион. Используя этот метод, ученые обнаружили, что CpG в материнском аллеле гена, кодирующего белок, MEA, имеют тенденцию метилироваться в эмбрионах, но не метилироваться в эндосперме, что указывает на тканеспецифический импринтинг.
Другие исследователи используют этот метод, чтобы понять, как экологические или социальные факторы могут изменить паттерны метилирования. Здесь детеныши мышей были отделены от своих матерей, чтобы вызвать стресс, а их мозговые ткани впоследствии были изолированы. После секвенирования обработанной бисульфитом ДНК ученые определили, что паттерны метилирования в гене, кодирующем гормон, AVP, изменялись в определенной области мозга у «отделенных» детенышей, что предполагает возможный молекулярный механизм долгосрочных биологических эффектов раннего жизненного опыта.
Наконец, многие исследователи пытаются оптимизировать анализ бисульфитов, чтобы облегчить сравнение паттернов метилирования между отдельными, уникальными клетками. Здесь исследователи модифицировали метод анализа бисульфитов таким образом, что все этапы выполнялись на отдельных ооцитах мыши, встроенных в агарозу, что помогло защититься от потери ДНК. Используя этот метод, исследователи смогли легко идентифицировать образцы с одним ооцитом, которые были загрязнены другими клетками, ища те, которые давали множественные паттерны метилирования.
Вы только что посмотрели видео JoVE о чувствительных к метилированию анализах. Здесь мы обсудили роль, которую метилирование ДНК играет в регуляции генов, методы, которые исследователи используют для идентификации метилированных областей в геноме, обобщенный протокол анализа бисульфитов и, наконец, некоторые применения этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр!
Метилирование в динуклеотидах CpG является химической модификацией ДНК, которая, как предполагается, играет важную роль в регуляции экспрессии генов.…
Метилирование ДНК — это химическая модификация ДНК, которая влияет на экспрессию генов в различных клеточных контекстах. Многих исследователей интересует механизм и функции этого процесса, поскольку аберрантное метилирование ДНК связано с такими заболеваниями, как рак.
В этом видео мы расскажем о принципах метилирования ДНК и методах его обнаружения. Затем мы рассмотрим общий протокол для одного из этих методов, анализ бисульфитов и некоторые применения этого метода.
Во-первых, давайте рассмотрим, что такое метилирование ДНК и как его можно обнаружить.
Во время этого биохимического процесса клетка добавляет химическую метку, известную как метильная группа, к основаниям цитозина в своей ДНК. Большинство метилированных цитозинов находятся рядом с основаниями гуанина в одной и той же цепи ДНК, и эти соседние нуклеотиды — и связывающая их фосфодиэфирная связь — называются «CpG». Хотя большинство CpG позвоночных метилированы, те, которые не метилированы, как правило, находятся близко друг к другу в «островках» CpG рядом с промоторами активно экспрессируемых генов. и различные другие элементы регуляторной последовательности.
Вопрос о том, как изменения в метилировании ДНК влияют на регуляцию генов, до сих пор является предметом интенсивных исследований. Метилирование CpG-островов, по-видимому, важно для стабильного, долгосрочного подавления экспрессии генов, наблюдаемого в эпигенетических процессах, таких как геномный импринтинг, который является специфической экспрессией определенных генов, а также инактивация Х-хромосомы, подавление одной из двух Х-хромосом в каждой клетке самок млекопитающих. Также было показано, что подавление критических генов из-за аберрантного метилирования островов CpG способствует неконтролируемому росту клеток, что может привести к раку. Механически метилирование ДНК может способствовать сайленсингу генов, либо предотвращая ассоциацию факторов транскрипции с промоторами, либо привлекая белки, которые модифицируют гистоны и ремоделируют хроматин в транскрипционно непермиссивное состояние.
Существует несколько методов определения состояния метилирования ДНК.
Один из методов, анализ HELP, включает в себя две эндонуклеазы рестрикции, называемые HpaII и MspI, которые соответственно расщепляют только неметилированные или одновременно метилированные и неметилированные последовательности CCGG. Сравнивая паттерны пищеварения, производимые этими двумя ферментами, можно сделать вывод о статусе метилирования ДНК.
Другой метод, называемый иммунопреципитацией метилированной ДНК или «MeDIP», использует антитела, которые связываются с метилированными цитозинами для обогащения метилированных последовательностей ДНК.
Наконец, анализ бисульфитов используется для того, чтобы отличить метилированный цитозин от неметилированного цитозина в ДНК, путем проведения химической реакции, которая превращает неметилированный цитозин в урацил. После этой конверсии обработанная бисульфитом ДНК может быть подвергнута ПЦР, секвенирована и сравнена с референсным геномом. Неметилированные цитозины — это те, которые присутствуют в референсе, но заменены на тимины после анализа бисульфита и ПЦР. Подвергая обработанную бисульфитом ДНК масс-спектрометрии, исследователи также могут создавать «эпиграммы метилирования», которые линейно представляют различные CpG в геноме и отображают степень метилирования в каждой из них. Такие эпиграммы особенно полезны, если исследователи хотят сравнить паттерны метилирования между различными типами клеток.
Давайте теперь подробно рассмотрим протокол для анализа бисульфитов.
Для начала гидроксид натрия добавляют к препаратам геномной ДНК, которые затем инкубируют при температуре 95°C. Это денатурирует ДНК и делает ее основания доступными для последующих химических реакций. Затем метабисульфит натрия вводится в смесь денатурированной ДНК, и происходит два этапа химической реакции. На первом этапе, сульфонировании, сульфитная группа добавляется к неметилированному цитозину с образованием цитозинсульфоната. Затем, во время гидрологического дезаминирования, аминогруппа удаляется из цитозина сульфоната с образованием урацилсульфоната.
Чтобы облегчить эти первые стадии химической реакции, препарат ДНК покрывают минеральным маслом, которое предотвращает испарение и помогает поддерживать концентрацию метабисульфита натрия. Затем реакцию инкубируют при температуре 55°C в темноте. На этом этапе в смесь также добавляется средство для предотвращения окисления, такое как хинол.
Для сбора модифицированной ДНК, содержащей сульфонат урацила и не содержащей минерального масла, смесь центрифугируют и восстанавливают самый нижний слой жидкости. Затем ДНК в этом растворе очищается.
Затем в смесь ДНК добавляют гидроксид натрия, который затем инкубируют при 37°C. Это делается для того, чтобы вызвать десульфонирование, которое, как вы, возможно, уже догадались, удаляет сульфитную группу из сульфоната урацила, образуя урацил и завершая химическую реакцию.
Наконец, смесь нейтрализуется с добавлением ацетата аммония, а ДНК собирается путем осаждения этанола. После того, как бисульфит-преобразованная ДНК была очищена, она подвергается ПЦР и секвенированию.
Теперь, когда мы обсудили основную технику анализа бисульфитов, давайте рассмотрим некоторые экспериментальные приложения.
Некоторые исследователи используют бисульфитный анализ для изучения геномного импринтинга. Здесь исследователи скрестили две разновидности Arabidopsis с генетическими различиями, чтобы можно было различить материнскую и отцовскую ДНК. Затем сравнивались паттерны метилирования в полученных эмбрионах и связанном с ним эндосперме или ткани, которая поддерживает эмбрион. Используя этот метод, ученые обнаружили, что CpG в материнском аллеле гена, кодирующего белок, MEA, имеют тенденцию метилироваться в эмбрионах, но не метилироваться в эндосперме, что указывает на тканеспецифический импринтинг.
Другие исследователи используют этот метод, чтобы понять, как экологические или социальные факторы могут изменить паттерны метилирования. Здесь детеныши мышей были отделены от своих матерей, чтобы вызвать стресс, а их мозговые ткани впоследствии были изолированы. После секвенирования обработанной бисульфитом ДНК ученые определили, что паттерны метилирования в гене, кодирующем гормон, AVP, изменялись в определенной области мозга у «отделенных» детенышей, что предполагает возможный молекулярный механизм долгосрочных биологических эффектов раннего жизненного опыта.
Наконец, многие исследователи пытаются оптимизировать анализ бисульфитов, чтобы облегчить сравнение паттернов метилирования между отдельными, уникальными клетками. Здесь исследователи модифицировали метод анализа бисульфитов таким образом, что все этапы выполнялись на отдельных ооцитах мыши, встроенных в агарозу, что помогло защититься от потери ДНК. Используя этот метод, исследователи смогли легко идентифицировать образцы с одним ооцитом, которые были загрязнены другими клетками, ища те, которые давали множественные паттерны метилирования.
Вы только что посмотрели видео JoVE о чувствительных к метилированию анализах. Здесь мы обсудили роль, которую метилирование ДНК играет в регуляции генов, методы, которые исследователи используют для идентификации метилированных областей в геноме, обобщенный протокол анализа бисульфитов и, наконец, некоторые применения этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр!
Метилирование ДНК — это химическая модификация ДНК, которая влияет на экспрессию генов в различных клеточных контекстах. Многих исследователей интересует механизм и функции этого процесса, поскольку аберрантное метилирование ДНК связано с такими заболеваниями, как рак.
В этом видео мы расскажем о принципах метилирования ДНК и методах его обнаружения. Затем мы рассмотрим общий протокол для одного из этих методов, анализ бисульфитов и некоторые применения этого метода.
Во-первых, давайте рассмотрим, что такое метилирование ДНК и как его можно обнаружить.
Во время этого биохимического процесса клетка добавляет химическую метку, известную как метильная группа, к основаниям цитозина в своей ДНК. Большинство метилированных цитозинов находятся рядом с основаниями гуанина в одной и той же цепи ДНК, и эти соседние нуклеотиды — и связывающая их фосфодиэфирная связь — называются «CpG». Хотя большинство CpG позвоночных метилированы, те, которые не метилированы, как правило, находятся близко друг к другу в «островках» CpG рядом с промоторами активно экспрессируемых генов. и различные другие элементы регуляторной последовательности.
Вопрос о том, как изменения в метилировании ДНК влияют на регуляцию генов, до сих пор является предметом интенсивных исследований. Метилирование CpG-островов, по-видимому, важно для стабильного, долгосрочного подавления экспрессии генов, наблюдаемого в эпигенетических процессах, таких как геномный импринтинг, который является специфической экспрессией определенных генов, а также инактивация Х-хромосомы, подавление одной из двух Х-хромосом в каждой клетке самок млекопитающих. Также было показано, что подавление критических генов из-за аберрантного метилирования островов CpG способствует неконтролируемому росту клеток, что может привести к раку. Механически метилирование ДНК может способствовать сайленсингу генов, либо предотвращая ассоциацию факторов транскрипции с промоторами, либо привлекая белки, которые модифицируют гистоны и ремоделируют хроматин в транскрипционно непермиссивное состояние.
Существует несколько методов определения состояния метилирования ДНК.
Один из методов, анализ HELP, включает в себя две эндонуклеазы рестрикции, называемые HpaII и MspI, которые соответственно расщепляют только неметилированные или одновременно метилированные и неметилированные последовательности CCGG. Сравнивая паттерны пищеварения, производимые этими двумя ферментами, можно сделать вывод о статусе метилирования ДНК.
Другой метод, называемый иммунопреципитацией метилированной ДНК или «MeDIP», использует антитела, которые связываются с метилированными цитозинами для обогащения метилированных последовательностей ДНК.
Наконец, анализ бисульфитов используется для того, чтобы отличить метилированный цитозин от неметилированного цитозина в ДНК, путем проведения химической реакции, которая превращает неметилированный цитозин в урацил. После этой конверсии обработанная бисульфитом ДНК может быть подвергнута ПЦР, секвенирована и сравнена с референсным геномом. Неметилированные цитозины — это те, которые присутствуют в референсе, но заменены на тимины после анализа бисульфита и ПЦР. Подвергая обработанную бисульфитом ДНК масс-спектрометрии, исследователи также могут создавать «эпиграммы метилирования», которые линейно представляют различные CpG в геноме и отображают степень метилирования в каждой из них. Такие эпиграммы особенно полезны, если исследователи хотят сравнить паттерны метилирования между различными типами клеток.
Давайте теперь подробно рассмотрим протокол для анализа бисульфитов.
Для начала гидроксид натрия добавляют к препаратам геномной ДНК, которые затем инкубируют при температуре 95°C. Это денатурирует ДНК и делает ее основания доступными для последующих химических реакций. Затем метабисульфит натрия вводится в смесь денатурированной ДНК, и происходит два этапа химической реакции. На первом этапе, сульфонировании, сульфитная группа добавляется к неметилированному цитозину с образованием цитозинсульфоната. Затем, во время гидрологического дезаминирования, аминогруппа удаляется из цитозина сульфоната с образованием урацилсульфоната.
Чтобы облегчить эти первые стадии химической реакции, препарат ДНК покрывают минеральным маслом, которое предотвращает испарение и помогает поддерживать концентрацию метабисульфита натрия. Затем реакцию инкубируют при температуре 55°C в темноте. На этом этапе в смесь также добавляется средство для предотвращения окисления, такое как хинол.
Для сбора модифицированной ДНК, содержащей сульфонат урацила и не содержащей минерального масла, смесь центрифугируют и восстанавливают самый нижний слой жидкости. Затем ДНК в этом растворе очищается.
Затем в смесь ДНК добавляют гидроксид натрия, который затем инкубируют при 37°C. Это делается для того, чтобы вызвать десульфонирование, которое, как вы, возможно, уже догадались, удаляет сульфитную группу из сульфоната урацила, образуя урацил и завершая химическую реакцию.
Наконец, смесь нейтрализуется с добавлением ацетата аммония, а ДНК собирается путем осаждения этанола. После того, как бисульфит-преобразованная ДНК была очищена, она подвергается ПЦР и секвенированию.
Теперь, когда мы обсудили основную технику анализа бисульфитов, давайте рассмотрим некоторые экспериментальные приложения.
Некоторые исследователи используют бисульфитный анализ для изучения геномного импринтинга. Здесь исследователи скрестили две разновидности Arabidopsis с генетическими различиями, чтобы можно было различить материнскую и отцовскую ДНК. Затем сравнивались паттерны метилирования в полученных эмбрионах и связанном с ним эндосперме или ткани, которая поддерживает эмбрион. Используя этот метод, ученые обнаружили, что CpG в материнском аллеле гена, кодирующего белок, MEA, имеют тенденцию метилироваться в эмбрионах, но не метилироваться в эндосперме, что указывает на тканеспецифический импринтинг.
Другие исследователи используют этот метод, чтобы понять, как экологические или социальные факторы могут изменить паттерны метилирования. Здесь детеныши мышей были отделены от своих матерей, чтобы вызвать стресс, а их мозговые ткани впоследствии были изолированы. После секвенирования обработанной бисульфитом ДНК ученые определили, что паттерны метилирования в гене, кодирующем гормон, AVP, изменялись в определенной области мозга у «отделенных» детенышей, что предполагает возможный молекулярный механизм долгосрочных биологических эффектов раннего жизненного опыта.
Наконец, многие исследователи пытаются оптимизировать анализ бисульфитов, чтобы облегчить сравнение паттернов метилирования между отдельными, уникальными клетками. Здесь исследователи модифицировали метод анализа бисульфитов таким образом, что все этапы выполнялись на отдельных ооцитах мыши, встроенных в агарозу, что помогло защититься от потери ДНК. Используя этот метод, исследователи смогли легко идентифицировать образцы с одним ооцитом, которые были загрязнены другими клетками, ища те, которые давали множественные паттерны метилирования.
Вы только что посмотрели видео JoVE о чувствительных к метилированию анализах. Здесь мы обсудили роль, которую метилирование ДНК играет в регуляции генов, методы, которые исследователи используют для идентификации метилированных областей в геноме, обобщенный протокол анализа бисульфитов и, наконец, некоторые применения этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is DNA methylation and where does it occur in the genome?
DNA methylation is a chemical modification where cells add a methyl group to cytosine bases in DNA. Most methylated cytosines occur next to guanine bases, forming CpG dinucleotides. Although most vertebrate CpGs are methylated, unmethylated CpGs tend to cluster together in CpG islands near gene promoters and regulatory elements, where they remain accessible for gene expression.
Q2: How does DNA methylation contribute to gene silencing?
DNA methylation silences genes through two mechanisms: it can prevent transcription factors from binding to promoters, or it can recruit proteins that modify histones and remodel chromatin into a transcriptionally non-permissive state. This stable silencing is particularly important in epigenetic processes such as genomic imprinting and X-chromosome inactivation, where genes are silenced based on their parent of origin or chromosome copy.
Q3: What are the main methods for detecting DNA methylation?
Three primary detection methods exist: the HELP assay uses restriction enzymes HpaII and MspI to compare digestion patterns of methylated versus unmethylated DNA; MeDIP uses antibodies to enrich methylated DNA sequences; and bisulfite analysis chemically converts unmethylated cytosines to uracil, allowing methylation status to be determined through PCR and sequencing.
Q4: What happens to DNA during the bisulfite analysis chemical reaction?
Bisulfite analysis involves two key chemical steps: sulfonation adds a sulfite group to unmethylated cytosines, forming cytosine sulfonate; then hydrolytic deamination removes an amino group to generate uracil sulfonate. Desulfonation subsequently removes the sulfite group, converting uracil sulfonate to uracil. This process leaves methylated cytosines unchanged, enabling distinction between methylated and unmethylated bases.
Q5: How is bisulfite-converted DNA analyzed after chemical treatment?
After bisulfite conversion and purification, the modified DNA is subjected to PCR and sequencing. Unmethylated cytosines appear as thymines in the sequenced product, while methylated cytosines remain as cytosines. Researchers can also use mass spectrometry to create methylation epigrams, which linearly represent different CpGs and depict the degree of methylation at each site, facilitating comparison between cell types.
Q6: How have researchers used bisulfite analysis to study genomic imprinting?
Researchers crossed Arabidopsis strains with genetic differences to distinguish maternal and paternal DNA, then compared methylation patterns in embryos and endosperm tissue. They found that CpGs in the maternal allele of the MEA gene were methylated in embryos but unmethylated in endosperm, demonstrating tissue-specific imprinting patterns that bisulfite analysis can reveal.
Q7: What role does aberrant DNA methylation play in cancer development?
Aberrant methylation of CpG islands can silence critical genes, leading to uncontrolled cell growth and cancer. Unlike normal epigenetic silencing, this abnormal methylation disrupts the balance of gene expression necessary for proper cell function. Understanding these methylation patterns through techniques like bisulfite analysis helps researchers identify molecular mechanisms underlying cancer and develop potential therapeutic strategies.
Главы в этом видео
0:00
Overview
0:42
Principles of DNA Methylation
4:07
Generalized Procedure for Bisulfite Analysis
6:14
Applications
8:17
Summary