Анализ метилирования ДНК

Метилирование ДНК — это химическая модификация ДНК, которая влияет на экспрессию генов в различных клеточных контекстах. Многих исследователей интересует механизм и функции этого процесса, поскольку аберрантное метилирование ДНК связано с такими заболеваниями, как рак.

В этом видео мы расскажем о принципах метилирования ДНК и методах его обнаружения. Затем мы рассмотрим общий протокол для одного из этих методов, анализ бисульфитов и некоторые применения этого метода.

Во-первых, давайте рассмотрим, что такое метилирование ДНК и как его можно обнаружить.

Во время этого биохимического процесса клетка добавляет химическую метку, известную как метильная группа, к основаниям цитозина в своей ДНК. Большинство метилированных цитозинов находятся рядом с основаниями гуанина в одной и той же цепи ДНК, и эти соседние нуклеотиды — и связывающая их фосфодиэфирная связь — называются «CpG». Хотя большинство CpG позвоночных метилированы, те, которые не метилированы, как правило, находятся близко друг к другу в «островках» CpG рядом с промоторами активно экспрессируемых генов. и различные другие элементы регуляторной последовательности.

Вопрос о том, как изменения в метилировании ДНК влияют на регуляцию генов, до сих пор является предметом интенсивных исследований. Метилирование CpG-островов, по-видимому, важно для стабильного, долгосрочного подавления экспрессии генов, наблюдаемого в эпигенетических процессах, таких как геномный импринтинг, который является специфической экспрессией определенных генов, а также инактивация Х-хромосомы, подавление одной из двух Х-хромосом в каждой клетке самок млекопитающих. Также было показано, что подавление критических генов из-за аберрантного метилирования островов CpG способствует неконтролируемому росту клеток, что может привести к раку. Механически метилирование ДНК может способствовать сайленсингу генов, либо предотвращая ассоциацию факторов транскрипции с промоторами, либо привлекая белки, которые модифицируют гистоны и ремоделируют хроматин в транскрипционно непермиссивное состояние.

Существует несколько методов определения состояния метилирования ДНК.

Один из методов, анализ HELP, включает в себя две эндонуклеазы рестрикции, называемые HpaII и MspI, которые соответственно расщепляют только неметилированные или одновременно метилированные и неметилированные последовательности CCGG. Сравнивая паттерны пищеварения, производимые этими двумя ферментами, можно сделать вывод о статусе метилирования ДНК.

Другой метод, называемый иммунопреципитацией метилированной ДНК или «MeDIP», использует антитела, которые связываются с метилированными цитозинами для обогащения метилированных последовательностей ДНК.

Наконец, анализ бисульфитов используется для того, чтобы отличить метилированный цитозин от неметилированного цитозина в ДНК, путем проведения химической реакции, которая превращает неметилированный цитозин в урацил. После этой конверсии обработанная бисульфитом ДНК может быть подвергнута ПЦР, секвенирована и сравнена с референсным геномом. Неметилированные цитозины — это те, которые присутствуют в референсе, но заменены на тимины после анализа бисульфита и ПЦР. Подвергая обработанную бисульфитом ДНК масс-спектрометрии, исследователи также могут создавать «эпиграммы метилирования», которые линейно представляют различные CpG в геноме и отображают степень метилирования в каждой из них. Такие эпиграммы особенно полезны, если исследователи хотят сравнить паттерны метилирования между различными типами клеток.

Давайте теперь подробно рассмотрим протокол для анализа бисульфитов.

Для начала гидроксид натрия добавляют к препаратам геномной ДНК, которые затем инкубируют при температуре 95°C. Это денатурирует ДНК и делает ее основания доступными для последующих химических реакций. Затем метабисульфит натрия вводится в смесь денатурированной ДНК, и происходит два этапа химической реакции. На первом этапе, сульфонировании, сульфитная группа добавляется к неметилированному цитозину с образованием цитозинсульфоната. Затем, во время гидрологического дезаминирования, аминогруппа удаляется из цитозина сульфоната с образованием урацилсульфоната.

Чтобы облегчить эти первые стадии химической реакции, препарат ДНК покрывают минеральным маслом, которое предотвращает испарение и помогает поддерживать концентрацию метабисульфита натрия. Затем реакцию инкубируют при температуре 55°C в темноте. На этом этапе в смесь также добавляется средство для предотвращения окисления, такое как хинол.

Для сбора модифицированной ДНК, содержащей сульфонат урацила и не содержащей минерального масла, смесь центрифугируют и восстанавливают самый нижний слой жидкости. Затем ДНК в этом растворе очищается.

Затем в смесь ДНК добавляют гидроксид натрия, который затем инкубируют при 37°C. Это делается для того, чтобы вызвать десульфонирование, которое, как вы, возможно, уже догадались, удаляет сульфитную группу из сульфоната урацила, образуя урацил и завершая химическую реакцию.

Наконец, смесь нейтрализуется с добавлением ацетата аммония, а ДНК собирается путем осаждения этанола. После того, как бисульфит-преобразованная ДНК была очищена, она подвергается ПЦР и секвенированию.

Теперь, когда мы обсудили основную технику анализа бисульфитов, давайте рассмотрим некоторые экспериментальные приложения.

Некоторые исследователи используют бисульфитный анализ для изучения геномного импринтинга. Здесь исследователи скрестили две разновидности Arabidopsis с генетическими различиями, чтобы можно было различить материнскую и отцовскую ДНК. Затем сравнивались паттерны метилирования в полученных эмбрионах и связанном с ним эндосперме или ткани, которая поддерживает эмбрион. Используя этот метод, ученые обнаружили, что CpG в материнском аллеле гена, кодирующего белок, MEA, имеют тенденцию метилироваться в эмбрионах, но не метилироваться в эндосперме, что указывает на тканеспецифический импринтинг.

Другие исследователи используют этот метод, чтобы понять, как экологические или социальные факторы могут изменить паттерны метилирования. Здесь детеныши мышей были отделены от своих матерей, чтобы вызвать стресс, а их мозговые ткани впоследствии были изолированы. После секвенирования обработанной бисульфитом ДНК ученые определили, что паттерны метилирования в гене, кодирующем гормон, AVP, изменялись в определенной области мозга у «отделенных» детенышей, что предполагает возможный молекулярный механизм долгосрочных биологических эффектов раннего жизненного опыта.

Наконец, многие исследователи пытаются оптимизировать анализ бисульфитов, чтобы облегчить сравнение паттернов метилирования между отдельными, уникальными клетками. Здесь исследователи модифицировали метод анализа бисульфитов таким образом, что все этапы выполнялись на отдельных ооцитах мыши, встроенных в агарозу, что помогло защититься от потери ДНК. Используя этот метод, исследователи смогли легко идентифицировать образцы с одним ооцитом, которые были загрязнены другими клетками, ища те, которые давали множественные паттерны метилирования.

Вы только что посмотрели видео JoVE о чувствительных к метилированию анализах. Здесь мы обсудили роль, которую метилирование ДНК играет в регуляции генов, методы, которые исследователи используют для идентификации метилированных областей в геноме, обобщенный протокол анализа бисульфитов и, наконец, некоторые применения этого метода. Как всегда, спасибо за просмотр!