Поколение побег вариантов нейтрализующих антител моноклональных вирус гриппа

Общая цель данного метода заключается в предоставлении рабочего протокола по определению эпитопа нейтрализующего моноклонального антитела. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области иммунологии и вирусологии, что поможет определить механизмы взаимодействия вируса с организмом хозяина, разработать терапевтические и диагностические средства, а также способствовать созданию вакцин. Основным преимуществом данной методики является то, что она может быть реализована с использованием базовых методов культивирования тканей и молекулярной биологии без применения специальных инструментов или оборудования.

Процедуру продемонстрирует Марк Бейли, врач, аспирант из лаборатории Питера Палезе. Начните выполнение данной процедуры с характеристики антител на основе подавления гемагглютинации (ПГА) и нейтрализующей активности, как описано в текстовом протоколе. Нейтрализующие антитела, обладающие ПГА-активностью, подвергаются дальнейшему анализу, для которого сначала готовят четыре разведения интересующих антител с возрастающей концентрацией в 1× PBS объемом 100 µL на каждое разведение.

Затем приготовьте вирусный сток в концентрации один миллион бляшкообразующих единиц на миллилитр в 1× PBS общим объемом 400 µL. После этого смешайте 100 µL вируса в концентрации один миллион бляшкообразующих единиц на миллилитр со 100 µL каждого разведения антител или со 100 µL 1× PBS. Инкубируйте образцы в течение одного часа в инкубаторе при 37 °C с 5% CO₂.

После кратковременного перемешивания на вортексе введите по 200 µL каждой смеси в специфически безпатогенные куриные эмбрионированные яйца. Затем инкубируйте яйца при 37 °C без углекислого газа в течение 40–44 часов. После инкубации уничтожьте инфицированные вирусом эмбрионированные яйца, выдержав их при 4 °C не менее шести часов.

Затем соберите аллантоидную жидкость из яиц, как было описано ранее. В завершение подтвердите наличие вариантов ускользания, проведя анализ HI, согласно текстовому протоколу. Для получения вариантов ускользания от нейтрализующих антител, не обладающих HI-активностью, вирус необходимо пассировать в присутствии возрастающих количеств антител.

Высейте клетки MDCK в шестилуночный планшет с плотностью один миллион клеток на лунку. Инкубируйте клетки в течение минимум четырех часов в инкубаторе при 37 °C с 5% carbon dioxide. Тем временем разведите вирусный сток до концентрации один миллион бляшкообразующих единиц на миллилитр.

Приготовьте однократное разведение антител в концентрации 0,02 мг/мл в 1х MEM с трипсином, обработанным TPCK, в объеме 250 мкл. Для всех последующих пассажей используйте более высокие концентрации антител. Смешайте 250 мкл разведенного вируса с 250 мкл разведенных антител или с 250 мкл 1х MEM в качестве контроля без антител.

Инкубируйте смесь вируса и антител в течение 30 минут в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2. После инкубации клеток удалите среду с помощью стеклянной пипетки Пастера и промойте монослой клеток 1 mL 1× PBS. Добавьте по 500 µL смеси в лунки перед инкубацией в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2 в течение одного часа.

Через один час добавьте в лунки по 2 мл 1х MEM с трипсином, обработанным TPCK. Через 48 часов после инфицирования проверьте клетки под микроскопом на наличие признаков цитопатического эффекта (ЦПЭ) или проведите анализ на гемагглютинацию для обнаружения роста вируса. Если в культуре, дополненной антителами, наблюдается ЦПЭ, соберите супернатант в несколько криопробирок.

Маркируйте пробирки с указанием номера пассажа и храните их при температуре -80 °C. Сохраните 100 µL супернатанта для заражения свежего монослоя MDCK с использованием 2 мл 1× MEM с добавлением TPCK-трипсина и антител. Не забудьте включить контрольный образец без антител для каждого пассажа.

Постепенно увеличивайте концентрацию антител в каждом последующем пассаже до тех пор, пока рост вируса остается возможным, вплоть до конечной концентрации антител 0,6 mg/mL. Заморозьте несколько пробирок супернатанта каждого пассажа и храните их при температуре -80 °C. Перейдите к изоляции и анализу выживших вариантов, как подробно описано в текстовом протоколе.

Для создания вариантов мутантов ускользания были использованы антитела, индуцированные вакциной, выделенные у лиц, вакцинированных кандидатной вакциной против гриппа А H7N9. Картирование мутантов ускользания показало, что многие антитела распознают критические остатки в различных участках вирусного HA. Каждый остаток, отмеченный красным, представляет собой положение критических аминокислот, необходимых для эффективного связывания моноклонального антитела, в то время как большинство HI-положительных антител имеют остатки мутантов ускользания рядом с ранее описанными антигенными сайтами H7HA. HI-отрицательные антитела создали мутантов ускользания с точечными мутациями в стеблевой области.

После освоения данный метод можно применять для выяснения структурных детерминант защиты от других патогенов. Этот метод ограничен не только созданием вариантов ускользания от моноклональных антител, но и от противовирусных соединений. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как определить связывающий эпитоп моноклональных антител путем создания вариантов ускользания in vitro.

При выполнении данной процедуры важно соблюдать осторожность при работе с вирусами и использовать соответствующие средства индивидуальной защиты.