Оценка микрососудистой функции человека жировой ткани с помощью Videomicroscopy

Общая цель данной видеомикроскопии заключается в изучении функциональных свойств изолированных микрососудов в ответ на фармакологические и физиологические стимулы, что дает представление о патофизиологии и молекулярных механизмах, способствующих сосудистой дисфункции у человека. Этот метод полезен для понимания молекулярных механизмов, которые способствуют дисфункции местного микроциркуляторного русла в жире, что связано с системными заболеваниями. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что кровеносные сосуды остаются функциональными после удаления из организма человека в течение определенного периода времени и легко исследуются на предмет их физиологических свойств.

Клиническая значимость этого экспериментального подхода заключается в том, что он позволяет нам идентифицировать пути, которые дифференциально изменяются в зависимости от состояния заболевания, и потенциально открывать новые терапевтические мишени. Под микроскопом для препарирования тканей с помощью микроножниц и микрощипцов осторожно удалите окружающий жир и соединительную ткань из мелких артерий в жировой пробе. Важно отличать артерии от венул.

Артерии, как правило, меньше в диаметре, демонстрируют больший тонус и реагируют более устойчиво, чем венулы. Когда артерия была изолирована, используйте нейлоновые или шелковые швы, чтобы перевязать любые ветви. Далее с помощью шприца объемом 10 миллилитров медленно заполните трубку свежим раствором Кребса.

Затем прикрепите резиновые трубки к резервуарам под давлением и стеклянные капиллярные пипетки внутри камеры. Далее переместите рассеченную артерию в камеру органа и канюлируйте сосуд на стеклянных капиллярных пипетках. Тщательно закрепите оба конца артерии на пипетках капроновыми швами.

Как только сосуд будет надежно закреплен, медленно извлеките буфер Кребса из камеры и добавьте в камеру два миллилитра свежего раствора Кребса. Далее прикрепите камеру органа к предметному столику перевернутого микроскопа, оснащенного видеокамерой. Включите программное обеспечение для обнаружения краев с частотой дискретизации один килогерц.

Подсоедините оставшиеся напорные трубки ко второму напорному бачку Кребса, заполненному раствором Кребса, а затем подсоедините напорные бачки к преобразователю давления. Когда все трубки будут подключены, установите нагревательный блок на 37 градусов Цельсия. Затем с помощью блока регулирования давления постепенно увеличивайте внутрипросветное давление до пяти миллилитров ртутного столба каждые пять минут для достижения соответствующего экспериментального давления в просвете изолированного кровеносного сосуда.

Дайте сосуду уравновеситься в течение 20-30 минут, как только давление достигнет 60 миллилитров ртутного столба, и запишите диаметр жировой артерии в состоянии покоя. В конце периода равновесия предварительно сужайте кровеносный сосуд примерно до 55% от исходного диаметра в состоянии покоя, добавляя один микролитр эндотелина 1 непосредственно в ванну каждые пять минут до тех пор, пока диаметр сосуда не будет соответствующим образом сужен. Для эндотелиально-зависимой вазодилатации, вызванной потоком, индуцируйте непрерывный поток во внутрипросветное пространство артерии в равных и противоположных направлениях, чтобы разность давлений могла развиваться поперек сосуда без изменения среднего внутрипросветного давления в 60 миллиметров ртутного столба.

Через три-пять минут измерьте расширение, опосредованное потоком. Увеличивайте каждый шаг градиента давления на 10 сантиметров подмены воды каждые пять-шесть минут, пока не будет максимум 100 сантиметров воды. После оценки расширения сосуда, опосредованного потоком, верните резервуары под давлением на ту же высоту, чтобы остановить индукцию потока.

Затем немедленно, но осторожно замените камерный раствор свежим раствором Кребса, не нарушая подвешенную артерию, и дайте сосуду начать возвращаться к исходному диаметру в течение 20 – 30 минут. После того, как артериальная артерия возвращается к исходному диаметру в состоянии покоя, можно оценить тонкую холин-опосредованную эндотелиальную зависимую вазодилатацию. Это начинается с предварительного сужения сосуда примерно до 55% от его диаметра покоя эндотелином 1, как было показано ранее.

Как только предварительное сужение будет достигнуто, добавьте два микролитра возрастающих доз ацетилхолина непосредственно в ванну. Запишите изменение диаметра артерии через пять минут после введения каждой дозы. По завершении ответа на дозу ацетилхолина оценить независимую от эндотелия вазодилатацию и жизнеспособность сосудов путем последовательного введения папаверина и эндотелиального независимого вазодилататора непосредственно в ванну.

Эндотелий-зависимые вазодилатационные реакции на увеличение кровотока и чистый стресс или ацетилхолин значительно притупляются в висцеральных и подкожных жировых артериях при ожирении у человека. Независимая от эндотелия вазодилатация в ответ на папаверин, однако, не изменяется дифференциально между двумя диспозициями, что позволяет предположить, что сосудистая дисфункция в висцеральных доменах в значительной степени является результатом дисфункции на уровне эндотелия, по крайней мере, на ранних стадиях заболевания. После освоения этой техники ее можно выполнить за три-пять часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь пройти эту процедуру, важно помнить о том, что нужно не торопиться и быть усердным, так как даже незначительные повреждения кровеносных сосудов могут исказить результаты. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как трансфекция миРНК кровеносных сосудов, чтобы ответить на дополнительные вопросы о влиянии конкретных генов на вазомоторную функцию при заболеваниях человека. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии жировой ткани и микроциркуляции к изучению влияния микроокружения жировой ткани на локальное здоровье сосудов при ожирении человека.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как непосредственно зондировать патофизиологию целых неповрежденных сегментов кровеносных сосудов человека, которые удаляются у живых людей, процесс, который не может быть воспроизведен с помощью неинвазивной визуализации.