Визуализация 3D белой жировой ткани структуры, с помощью окрашивания целом гора
November 17th, 2018
В центре внимания настоящего исследования заключается в демонстрации целом гора иммуноокрашивания и визуализации метод как метод идеально подходит для 3D визуализация архитектуры и сотовых составляющей жировой ткани.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области жировой биологии, такие как, как межклеточные взаимодействия и физиология жировой ткани меняются при различных метаболических условиях, таких как пост и ожирение. Основным преимуществом этого метода является то, что он оптимально сохраняет оригинальную жировую 3D структуру и избегает длительных этапов обработки, которые обычно необходимы для обычной иммуногистохимии. Хотя этот метод может обеспечить понимание структуры жировой ткани, он также может быть применен к другим системам органов, таких как нервная система, путем цельного монтажа окрашивания мозга.
Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться из-за трудностей в получении свойств тканей сайтов, найти надлежащий период фиксации, и оптимальные концентрации антител. После того, как вскрытие завершено, перенесите блюдо, содержащее образцы тканей в 1%paraformaldehyde от льда к комнатной температуре в течение одного часа. Затем перенесите ткани либо в 12 или 24-хорошо клеточной культуры пластины для более быстрого мытья.
Важно помнить, что процедура окрашивания вся должна начинаться сразу после вскрытия и что между каждым шагом нет точек паузы. Вымойте ткани с PBS-0.3T на шейкер наклонен на 22 градусов со скоростью от 20 до 25 наклонов в минуту при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите эту стирку еще два раза.
После этого добавьте примерно 0,5 к одному миллилитру блокирующего буфера, содержащего 5%животной сыворотки. Инкубировать пластину на шейкере, используя предыдущие условия в течение одного часа. Аспирировать блокирующий раствор, и добавить на миллилитр первичных антител, разбавленных в PBS-0.3T с 1%животной сыворотки к каждому хорошо.
Инкубировать пластину на ночь на шейкере при четырех градусах по Цельсию с наклоном 22 градусов и скоростью от 20 до 25 наклонов в минуту. На следующий день используйте PBS-0.3T для мытья тканей при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите эту стирку еще два раза.
Затем добавьте от 0,5 до одного миллилитра соответствующих и разбавленных вторичных антител решений для каждой хорошо. Оберните пластину в алюминиевую фольгу и инкубировать его на шейкер при комнатной температуре в течение одного часа. После этого, мыть пластину дважды с PBS-0.3T при комнатной температуре в течение пяти минут за стирку.
Если визуализация жидких капель необходима во время нейтрального липидного пятна, мыть дважды с 1x PBS с каждой стирки продолжительностью пять минут. Добавить нейтральное липидное пятно, разбавленное в PBS, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Чтобы начать визуализацию, используйте типсы, чтобы заложить ткань плоской на 24 на 60 миллиметров стеклянной крышкой скольжения.
Если необходимо окрашивание ядер DAPI, добавьте одну-две капли монтажной среды, которая содержит DAPI, чтобы полностью погрузить ткань и предотвратить ее высыхание. Затем поместите слайд на перевернутую систему конфокального лазерного микроскопа. Для получения изображений цельно-монтируемых окрашенных тканей на нескольких фокусных плоскостях выполните стеки от 100 до 150 микрометров в глубину с размером шага от четырех до шести микрометров при желаемом увеличении.
В этом исследовании, цельно-монтажное окрашивание используется для сохранения архитектуры жировой ткани. В отличие от методов, которые включают в себя несколько этапов обработки и секций, которые могут привести к обезображиванию морфологии жировой ткани, цельно-монтажный метод окрашивания может сохранить морфологию адипоцитов, обеспечивая точность при интерпретации результатов. Перефиксация жировой ткани приводит к фиксации индуцированной флуоресценции, которая может быть указана перекрывающихся идентичных регионах, таких как гидроксилазы тирозина и PECAM-1 сигналы видели здесь.
Правильно фиксированные, цельно-монтажные образцы пятен, однако, показывают отдельные и четкие сигналы, указывающие на то, что эти сигналы не являются аутофторесценцией. Изображение цельно-монтажной жировой ткани позволяет количественно оценить морфологические изменения в различных экспериментальных условиях. В частности, жировая ткань высоко васкуляризирована, что важно при посредничестве метаболического гомеостаза при быстрых изменениях энергетического уровня.
Например, C57 черные мыши 6J, которые проходят 24 часов поста, отображают значительно меньший размер адипоцитов, что указывает на липолиз, и тенденция в повышенной плотности кровеносных сосудов по сравнению с постоянно кормили мышей. Очистка жировых тканей с помощью iDISCO позволяет жировой ткани стать оптически прозрачными. Иммунолабелирование жировой ткани, которая прошла через очистку тканей показывает гораздо плотнее нейронной арборизации по сравнению с тем, что наблюдается в цельно-монтажного окрашивания без очистки тканей при том же увеличении.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы не перефиксированы образцы в течение более часа при комнатной температуре в PFA, в противном случае, это увеличит фон аутофторесценции. Однако этот период фиксации может быть продлен, если образцы фиксируются при четырех градусах Цельсия. После этой процедуры, другие методы, такие как количественная оценка с помощью ImageJ, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как, например, клеточной архитектуры, такие как адипоциты сайтов и плотность кровеносных сосудов, изменения в ответ на различные физиологические условия.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование демонстрирует метод целостного иммуноокрашивания, идеальный для 3D-визуализации архитектуры жировой ткани и её клеточных компонентов. Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы биологии жировой ткани, особенно на вопрос о том, как межклеточные взаимодействия и физиология ткани меняются в условиях метаболических состояний, таких как голодание и ожирение.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Архитектура жировой ткани
- Клеточные взаимодействия в метаболических состояниях
- Методы иммуноокрашивания
Предыстория
- Важность сохранения морфологии жировой ткани
- Ограничения традиционной иммуногистохимии
- Потенциальные применения в других системах органов
Использованные методы
- Целостное иммуноокрашивание
- Жировая ткань и другие системы органов
- Конфокальная лазерная микроскопия для визуализации
Основные результаты
- Целостное окрашивание сохраняет морфологию адипоцитов и позволяет точно интерпретировать результаты
- Значительные изменения в размере адипоцитов и плотности кровеносных сосудов наблюдались при голодании
- Демонстрирует повышенную видимость нервных структур после очищения ткани
Выводы
- Метод эффективно сохраняет 3D-структуру жировой ткани, облегчая изучение метаболических реакций
- Он предоставляет представление о клеточной архитектуре и функциональности жировой ткани, релевантной для метаболических исследований
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Preserving native 3D adipose tissue architecture enables accurate assessment of metabolic responses and intercellular interactions under physiological stress. This approach supports target validation by maintaining morphological fidelity, reducing artifacts that confound mechanistic interpretation in obesity and diabetes research. Whole-mount staining provides a scalable, reproducible platform for phenotypic screening of adipose remodeling in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of adipocyte morphology and vascular density changes under metabolic conditions like fasting.
- Operational Value: Preserves intact tissue structure without sectioning artifacts, improving data reliability for target hypothesis testing.
- Predictive Value: Supports functional assessment of adipose tissue plasticity, aiding in de-risking targets involved in lipid metabolism and energy homeostasis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Compatible with lineage tracing and neutral lipid staining to quantify cellular fate and lipid storage dynamics.
- Operational Value: Standardized washing and blocking steps using PBS-0.3T and animal serum ensure reproducibility across samples.
- Scalability: Compatible with 12- or 24-well plate formats, facilitating medium-throughput imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal assessment of adipocyte size and vascular remodeling in disease models.
- Operational Value: When combined with tissue clearing (e.g., iDISCO+), allows whole-organ neural mapping in adipose tissue.
- Translational Continuity: Supports correlation of structural changes with functional metabolic readouts like lipolysis and glucose homeostasis.
Pipeline & Workflow Integration
Whole-mount staining fits within the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical assessment of metabolic tissue responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how nutrient status alters adipose tissue architecture and cellular interactions.
- Screening: Enables standardized, quantitative imaging of adipocyte morphology and vascular density across experimental conditions.
- Analytics: Facilitates Z-stack confocal imaging and ImageJ-based morphometric analysis for objective comparison of structural phenotypes.
- Translational Research: Links structural observations (e.g., adipocyte shrinkage, vascular density) to physiological states like fasting-induced lipolysis.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organ systems (e.g., nervous system), increasing platform utility across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by preserving native 3D tissue architecture for accurate phenotype interpretation.
- Operational Value: Minimizes processing steps and fixation variability, enhancing reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable structural data on target engagement in metabolic tissues.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on adipose tissue remodeling profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, fixation timing, and antibody optimization to avoid overfixation artifacts.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure capable of Z-stack acquisition at 4–6 μm step sizes.
- Necessitates standardization of washing conditions (PBS-0.3T, 20–25 tilts/min, 22° tilt) for consistent staining.
- Adaptation to clearing protocols (e.g., iDISCO+) may be required for deep-tissue neural visualization.
- Limited by light scattering in uncleared tissues, restricting depth of accurate signal detection without clearing.
![Визуализация и количественная оценка коричневых и бежевых жировых тканей у мышей с использованием [18F]FDG Micro-PET/MR Визуализация](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A25%253A48.878Z&w=384&q=75)
