Визуализация 3D белой жировой ткани структуры, с помощью окрашивания целом гора
17 ноября 2018 г.
В центре внимания настоящего исследования заключается в демонстрации целом гора иммуноокрашивания и визуализации метод как метод идеально подходит для 3D визуализация архитектуры и сотовых составляющей жировой ткани.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области жировой биологии, такие как, как межклеточные взаимодействия и физиология жировой ткани меняются при различных метаболических условиях, таких как пост и ожирение. Основным преимуществом этого метода является то, что он оптимально сохраняет оригинальную жировую 3D структуру и избегает длительных этапов обработки, которые обычно необходимы для обычной иммуногистохимии. Хотя этот метод может обеспечить понимание структуры жировой ткани, он также может быть применен к другим системам органов, таких как нервная система, путем цельного монтажа окрашивания мозга.
Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться из-за трудностей в получении свойств тканей сайтов, найти надлежащий период фиксации, и оптимальные концентрации антител. После того, как вскрытие завершено, перенесите блюдо, содержащее образцы тканей в 1%paraformaldehyde от льда к комнатной температуре в течение одного часа. Затем перенесите ткани либо в 12 или 24-хорошо клеточной культуры пластины для более быстрого мытья.
Важно помнить, что процедура окрашивания вся должна начинаться сразу после вскрытия и что между каждым шагом нет точек паузы. Вымойте ткани с PBS-0.3T на шейкер наклонен на 22 градусов со скоростью от 20 до 25 наклонов в минуту при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите эту стирку еще два раза.
После этого добавьте примерно 0,5 к одному миллилитру блокирующего буфера, содержащего 5%животной сыворотки. Инкубировать пластину на шейкере, используя предыдущие условия в течение одного часа. Аспирировать блокирующий раствор, и добавить на миллилитр первичных антител, разбавленных в PBS-0.3T с 1%животной сыворотки к каждому хорошо.
Инкубировать пластину на ночь на шейкере при четырех градусах по Цельсию с наклоном 22 градусов и скоростью от 20 до 25 наклонов в минуту. На следующий день используйте PBS-0.3T для мытья тканей при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите эту стирку еще два раза.
Затем добавьте от 0,5 до одного миллилитра соответствующих и разбавленных вторичных антител решений для каждой хорошо. Оберните пластину в алюминиевую фольгу и инкубировать его на шейкер при комнатной температуре в течение одного часа. После этого, мыть пластину дважды с PBS-0.3T при комнатной температуре в течение пяти минут за стирку.
Если визуализация жидких капель необходима во время нейтрального липидного пятна, мыть дважды с 1x PBS с каждой стирки продолжительностью пять минут. Добавить нейтральное липидное пятно, разбавленное в PBS, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Чтобы начать визуализацию, используйте типсы, чтобы заложить ткань плоской на 24 на 60 миллиметров стеклянной крышкой скольжения.
Если необходимо окрашивание ядер DAPI, добавьте одну-две капли монтажной среды, которая содержит DAPI, чтобы полностью погрузить ткань и предотвратить ее высыхание. Затем поместите слайд на перевернутую систему конфокального лазерного микроскопа. Для получения изображений цельно-монтируемых окрашенных тканей на нескольких фокусных плоскостях выполните стеки от 100 до 150 микрометров в глубину с размером шага от четырех до шести микрометров при желаемом увеличении.
В этом исследовании, цельно-монтажное окрашивание используется для сохранения архитектуры жировой ткани. В отличие от методов, которые включают в себя несколько этапов обработки и секций, которые могут привести к обезображиванию морфологии жировой ткани, цельно-монтажный метод окрашивания может сохранить морфологию адипоцитов, обеспечивая точность при интерпретации результатов. Перефиксация жировой ткани приводит к фиксации индуцированной флуоресценции, которая может быть указана перекрывающихся идентичных регионах, таких как гидроксилазы тирозина и PECAM-1 сигналы видели здесь.
Правильно фиксированные, цельно-монтажные образцы пятен, однако, показывают отдельные и четкие сигналы, указывающие на то, что эти сигналы не являются аутофторесценцией. Изображение цельно-монтажной жировой ткани позволяет количественно оценить морфологические изменения в различных экспериментальных условиях. В частности, жировая ткань высоко васкуляризирована, что важно при посредничестве метаболического гомеостаза при быстрых изменениях энергетического уровня.
Например, C57 черные мыши 6J, которые проходят 24 часов поста, отображают значительно меньший размер адипоцитов, что указывает на липолиз, и тенденция в повышенной плотности кровеносных сосудов по сравнению с постоянно кормили мышей. Очистка жировых тканей с помощью iDISCO позволяет жировой ткани стать оптически прозрачными. Иммунолабелирование жировой ткани, которая прошла через очистку тканей показывает гораздо плотнее нейронной арборизации по сравнению с тем, что наблюдается в цельно-монтажного окрашивания без очистки тканей при том же увеличении.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы не перефиксированы образцы в течение более часа при комнатной температуре в PFA, в противном случае, это увеличит фон аутофторесценции. Однако этот период фиксации может быть продлен, если образцы фиксируются при четырех градусах Цельсия. После этой процедуры, другие методы, такие как количественная оценка с помощью ImageJ, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как, например, клеточной архитектуры, такие как адипоциты сайтов и плотность кровеносных сосудов, изменения в ответ на различные физиологические условия.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен метод иммуноокрашивания целых образцов, который идеально подходит для 3D-визуализации архитектуры жировой ткани и ее клеточных компонентов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы биологии жировой ткани, в частности, о том, как межклеточные взаимодействия и физиология ткани изменяются при таких метаболических состояниях, как голодание и ожирение.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Архитектура жировой ткани
- Клеточные взаимодействия при метаболических нарушениях
- Методы иммуноокрашивания
Теоретические основы
- Важность сохранения морфологии жировой ткани
- Ограничения традиционного иммуногистохимического анализа
- Потенциальные области применения в других системах органов
Используемые методы
- Иммуноокрашивание целого препарата
- Жировая ткань и другие системы органов
- Конфокальная лазерная микроскопия для визуализации
Основные результаты
- Окрашивание целого препарата позволяет сохранить морфологию адипоцитов и обеспечить точную интерпретацию результатов
- При голодании наблюдаются значительные изменения размера адипоцитов и плотности кровеносных сосудов
- Продемонстрировано улучшение видимости нейронных структур после просветления ткани
Выводы
- Данный метод эффективно сохраняет трехмерную структуру жировой ткани, что облегчает изучение метаболических реакций
- Он позволяет получить представление о клеточной архитектуре и функциональности жировой ткани, имеющих значение для метаболических исследований
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Сохранение естественной трехмерной архитектуры жировой ткани позволяет точно оценить метаболические реакции и межклеточные взаимодействия при физиологическом стрессе. Такой подход способствует валидации мишеней за счет сохранения морфологической точности и снижения количества артефактов, которые затрудняют механистическую интерпретацию в исследованиях ожирения и диабета. Окрашивание целых препаратов обеспечивает масштабируемую и воспроизводимая платформу для фенотипического скрининга ремоделирования жировой ткани в доклинических моделях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать изменения морфологии адипоцитов и плотности сосудов при таких метаболических состояниях, как голодание.
- Практическая ценность: сохраняет целостность структуры ткани без артефактов секционирования, что повышает достоверность данных при проверке целевых гипотез.
- Прогностическая ценность: обеспечивает функциональную оценку пластичности жировой ткани, помогая снизить риски при поиске мишеней, участвующих в липидном обмене и энергетическом гомеостазе.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Совместимость с методами отслеживания линий клеток и окрашивания нейтральных липидов для количественной оценки судьбы клеток и динамики накопления липидов.
- Практическая ценность: Стандартизированные этапы промывки и блокировки с использованием PBS-0.3T и сыворотки животных обеспечивают воспроизводимость результатов между образцами.
- Масштабируемость: Совместимость с форматами планшетов на 12 или 24 лунки, что облегчает выполнение рабочих процессов визуализации со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает возможность лонгитюдной оценки размера адипоцитов и сосудистого ремоделирования в моделях заболеваний.
- Практическая ценность: в сочетании с методами просветления тканей (например, iDISCO+) позволяет проводить картирование нейронных связей всего органа в жировой ткани.
- Трансляционная преемственность: способствует корреляции структурных изменений с функциональными метаболическими показателями, такими как липолиз и гомеостаз глюкозы.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Окрашивание целых образцов является частью процесса исследований, охватывающего путь от валидации мишени и фенотипического скрининга до доклинической оценки метаболических ответов тканей.
- Фундаментальная биология: позволяет проверить гипотезы о том, как статус питательных веществ изменяет архитектуру жировой ткани и клеточные взаимодействия.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированную количественную визуализацию морфологии адипоцитов и плотности сосудов при различных экспериментальных условиях.
- Аналитика: облегчает получение Z-стеков при конфокальной микроскопии и проведение морфометрического анализа в ImageJ для объективного сравнения структурных фенотипов.
- Трансляционные исследования: связывает структурные наблюдения (например, уменьшение размера адипоцитов, плотность сосудов) с физиологическими состояниями, такими как липолиз, вызванный голоданием.
- Корпоративное повторное использование: метод может быть адаптирован для других систем органов (например, нервной системы), что расширяет возможности платформы в рамках различных программ исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет сохранения нативной трехмерной архитектуры ткани для точной интерпретации фенотипа.
- Операционная ценность: Минимизирует количество этапов обработки и вариативность фиксации, что повышает воспроизводимость результатов в разных лабораториях.
- Стратегическая ценность: Облегчает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя надежные структурные данные о взаимодействии с мишенью в метаболических тканях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию соединений с учетом рисков на основе профилей ремоделирования жировой ткани.
Особенности реализации
- Требуется опыт в препарировании тканей, соблюдении сроков фиксации и оптимизации антител для предотвращения артефактов гиперфиксации.
- Зависит от наличия инфраструктуры конфокальной микроскопии, позволяющей выполнять Z-стекирование с шагом 4–6 μm.
- Необходима стандартизация условий промывки (PBS-0.3T, 20–25 наклонов/мин, угол наклона 22°) для достижения однородного окрашивания.
- Для визуализации нейронов в глубоких слоях ткани может потребоваться адаптация к протоколам просветления (например, iDISCO+).
- Ограничено рассеиванием света в непросветленных тканях, что ограничивает глубину точного детектирования сигнала без проведения процедуры просветления.
![Визуализация и количественная оценка коричневых и бежевых жировых тканей у мышей с использованием [18F]FDG Micro-PET/MR Визуализация](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A22.161Z&w=384&q=75)
