Стандартизованный метод измерения внутренней площади поверхности легких с помощью мышечной пневмоэнцетомии и имплантации протезов

Общая цель этой процедуры заключается в точном измерении площади внутренней поверхности легкого мыши после пневмонэктомии и имплантации протеза. Этот метод помогает проанализировать морфологические и физиологические функции легких при механической регенерации легких взрослого человека, вызванной механической силой. Основным преимуществом этого метода является точная количественная оценка внутренней площади поверхности легких, что обещает повысить надежность и воспроизводимость состояния функции легких.

Подготовьте мышь к операции на платформе для интубации с доступом к ее вентральной стороне. Затем вытащите язычок и осмотрите голосовые связки с помощью ларингоскопа для мелких животных, совместимого с направляющими катетерами. Затем аккуратно введите канюлю для внутривенной интубации 20 калибра в трахею под внутренним углом.

Далее поставьте мышь в правое боковое лежачее положение и подключите канюлю к аппарату искусственной вентиляции легких. Понаблюдайте за грудной клеткой, чтобы судить о введении канюли в трахею. Установите давление на вдохе на уровне 12 сантиметров воды и установите частоту дыхания на уровне 120 вдохов в минуту.

Теперь очистите открытые участки кожи не менее чем тремя чередующимися скрабами бетадина и 70% этанола. Затем начните операцию с двух-трехсантиметрового заднебокового торакотомического разреза в пятом межреберье. Проникните в мускулатуру с помощью пружинных ножниц Нойеса.

Далее сделайте разрез на 1,5 сантиметра, чтобы обнажить левое легкое. При необходимости на протяжении всей операции используйте высокотемпературный прижигатель для остановки кровотечения. Затем приподнимите 1/3 левой доли легкого от грудной клетки тупыми щипцами и с помощью ватного тампона вытяните все левое легкое.

Теперь определите легочную артерию и бронхи левой доли легкого и плотно перевязайте бронхи и сосуды в воротах пропитанным хирургическим швом. Затем вырежьте левую долю легкого в трех-четырех миллиметрах от места перевязки, стараясь не срезать шов, который может привести к пневмотораксу. Далее закройте грудную стенку одним швом.

Затем прострочите мышечный слой и слой кожи последовательно, используя пять-шесть прерывистых швов с трех-четырьмя миллиметровыми зазорами. Обязательно держите иглу для хирургического шва подальше от сердца. Пункция сердца приводит к летальному исходу.

Наконец, продезинфицируйте операционную область повидон-йодом. Затем поместите мышь на термопрокладку с температурой 38 градусов Цельсия. Продолжайте использовать аппарат искусственной вентиляции легких до тех пор, пока не вернется спонтанное дыхание.

Выполните ранее описанную операцию, но сразу после удаления легкого подготовьтесь к установке протеза. С помощью тупых щипцов захватите центр эллипсоидного силиконового протеза. Далее, придерживая ребро щипцами, чтобы обнажить грудную полость, очень аккуратно введите протез.

Введите под углом 45 градусов между фронтальной плоскостью протеза и грудной поверхностью. С помощью тупых щипцов убедитесь, что протез полностью находится в левой пустой грудной полости. Теперь закройте сундук и следите за мышью, как описано ранее.

Для этой процедуры соберите специальную трубку для надувания, которая состоит из поршня, извлеченного из серологической пипетки объемом 10 миллилитров, гибкой трубки длиной 40 сантиметров с адаптером для иглы, клапана управления расходом и иглы 18 калибра. После сборки закрепите пипетку на буфете с помощью скотча. Расстояние между верхней частью пипетки и скамьей должно быть не менее 30 сантиметров.

После усыпления мыши с помощью инъекции анестезии закрепите ее на стерилизованной доске и осторожно вскройте грудную клетку, чтобы вырезать грудину и обнажить доли легких. Затем обнажите трахею. Далее наполните трубку свежеприготовленным 4%-ным PFA и удалите все пузырьки из трубки.

Затем введите иглу в трахею. Во избежание протекания зафиксируйте трахею зажимами для сосудов. Теперь накачайте легкое фиксатором при постоянном транспульмональном давлении в 25 сантиметров воды.

Инкубируйте легкие при комнатной температуре в течение двух часов для полного расширения. После накачивания обратите внимание на смещение объема фиксатора. Теперь перевяжите трахею и аккуратно рассеките легкие, неповрежденные от окружающих соединительных тканей.

Используйте ножницы и будьте очень аккуратны. Затем инкубируйте легкие в конической трубке объемом 50 миллилитров, заполненной 4% PFA, в течение 12 часов при температуре четыре градуса Цельсия с легким встряхиванием на шейкере. Затем приступайте к обработке и окрашиванию, как описано в текстовом протоколе.

Для количественной оценки MLI используйте изображения используемого агента в срезах, собранных в светлом поле с 20-кратным увеличением. Из трех разных срезов легких случайным образом выберите в общей сложности 15 неперекрывающихся видов, каждый площадью около одного квадратного миллиметра, а затем проветрите их. Используйте только участки без артерий и вен, магистральных дыхательных путей или альвеолярных протоков.

Для анализа нарисуйте сетку 10 на 10 над каждой выделенной областью с помощью инструмента линейки. Таким образом, линии сетки находятся на расстоянии около 100 микрон друг от друга. Затем найти пересечение по линии, равной длине между двумя соседними альвеолярными эпителиями.

Например, двунаправленные стрелки иллюстрируют длины. Подсчитайте все эти длины вдоль каждой линии сетки, и MLI будет средним значением длин пересечения. Используя описанные протоколы, мышей, получавших PNX, сравнивали с мышами, которым имплантировали протезы.

В качестве мышей использовались 8-недельные самцы CD-1, и их левые доли легких были резецированы. Протез имитирует размер и форму левой доли легкого и был вставлен в грудную клетку после удаления левой доли легкого. Через 14 дней после операции была использована специально изготовленная трубка для надувания для определения внутреннего объема оставшегося правого легкого.

Средний объем правого легкого у пяти мышей, получавших PNX, составил примерно 1,4 миллилитра, что было значительно больше, 1,05 миллилитра для пяти мышей, которым были имплантированы протезы. Значения MLI в остальных правых легких также были достоверно выше. Используя эти параметры, была рассчитана внутренняя площадь поверхности легких, и было обнаружено, что она значительно меньше у мышей, которым имплантировали протезы.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как рассчитать внутреннюю площадь поверхности легких для модели мыши, вызванной механической силой альвеолярной регенерации.