Условное нокдаун экспрессии генов в рак клеточных линий для изучения набора моноцитов/макрофагов в микроокружения опухоли

В целом этот протокол заключается в использовании условного нокдауна экспрессии генов в раковых клетках для изучения рекрутирования моноцитов и макрофагов в микроокружение опухоли in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроокружения опухоли относительно природы перекрестного запаса между раковыми клетками и клетками иммунной системы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что используемая здесь система требует одновекторного клонирования, позволяет быстро генерировать несколько клонов и демонстрирует очень низкий уровень толщины.

Также продемонстрирован метод очистки моноцитов человека без прямого контакта с антителами, который позволяет избежать случайной активации и в результате чего популяция моноцитов человека составляет более 95%. Чтобы получить вирусные частицы, трансфектируйте 70%-ные 150-миллиметровые чашки клеток HEK-293 25 микрограммами pLKO-tet-on shRNA, 25 микрограммами упаковочной плазмиды psPAX и пятью микрограммами плазмиды pMD2, экспрессирующей оболочку. G с использованием реагента для трансфекции в соответствии со стандартными протоколами.

Добавьте смесь в 150-миллиметровую посуду. На следующий день индуцируйте выработку лентивирусов в клетках, изменив среду на DMEM с добавлением 10 миллимолярного бутирата натрия и 20 миллимолярного HEPES. Культивируйте в течение восьми часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Через восемь часов промойте клетки PBS и добавьте 25 миллилитров свежей среды DMEM с 20 миллимолярными HEPES и без бутирата натрия. После инкубации в течение 48 часов тщательно соберите вируссодержащую среду с помощью пипетки. Чтобы получить стабильные клеточные линии, начните с посева клеток рака толстой кишки HCT-116 и клеток рака молочной железы MDA-MB-231 в 12-луночный планшет по 50 000 клеток в лунку.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Когда клетки сплывут на 60-70%, промойте клетки PBS и добавьте в каждую лунку по одному миллилитру вируссодержащей среды. На следующий день осторожно удалите вируссодержащую среду методом аспирации.

Затем, промыв клетки PBS, добавьте среду, содержащую FBS, не содержащую тетрациклина. Через 72 часа промойте клетки, как и раньше, и добавьте среду с добавлением одного микрограмма на миллилитр пуромицина для отбора клеток, трансфицированных вирусом. Отбирают клетки, трансдуцированные вирусом, путем культивирования клеток в присутствии пуромицина в течение от трех до 14 дней.

Наблюдайте частичное уничтожение лунок пуромицином в клетках с вирус-трансдуцированными клетками. Нетрансдуцированные клетки не будут расти в присутствии пуромицина. Когда эти контрольные клетки погибают, продолжайте культивирование условно регулируемых клеточных линий в течение двух недель в присутствии антибиотиков для создания условно регулируемых клеточных линий.

Проверить эффективность условного нокдауна в клетках пуромицин-резистентного рака толстой кишки HCT-116 и MDA-MB-231 рака молочной железы путем добавления среды с различными концентрациями доксициклина и культивирования клеток в течение 72 часов. После приготовления клеточного лизата проверьте уровень нокдауна с помощью вестерн-блоттинга. Уровни PAI-1 показаны здесь.

Чтобы выделить моноциты периферической крови, сначала приготовьте три пробирки по 50 миллилитров, содержащие 15 миллилитров раствора градиента плотности. Затем используйте контроллер пипетки, настроенный на гравитационный поток, чтобы медленно наложить 30 миллилитров разбавленной крови на раствор градиента плотности. Центрифугировать в качающемся роторе при 400 г при комнатной температуре без перерывов в течение 25 минут.

После центрифугирования утилизируйте верхний слой и перенесите средний слой, содержащий мононуклеарные клетки периферической крови, в свежую пробирку объемом 50 миллилитров и добавьте PBS с добавлением FBS до 50 миллилитров. Центрифугируйте при 120 г при комнатной температуре в течение 10 минут. После отжима удалите содержащую тромбоцитосодержащую надосадочную жидкость.

После окончательного центрифугирования и сбора повторно суспендируйте гранулу в 50 миллилитрах FBS с дополнением PBS и подсчитайте мононуклеарные клетки периферической крови с помощью гемоцитометра. После центрифугирования клеток при давлении 120 г ресуспендируйте гранулу в PBS с добавлением FBS, содержащем одну миллимолярную ЭДТА, до конечной концентрации 50 миллионов клеток на миллилитр. Затем начинают обогащать на моноциты, добавляя 50 микролитров коктейля антител отрицательного отбора на каждый миллилитр клеточной суспензии и смешивают.

Выдерживать 10 минут при комнатной температуре. После инкубации добавьте 50 микролитров магнитных шариков на миллилитр, перемешайте и выдержите еще 10 минут. Затем добавьте PBS с FBS и ЭДТА до 25 миллилитров и поместите мононуклеарную смесь периферической крови в магнит, который может вместить 50-миллилитровую трубку.

После инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре магнитные шарики прилипнут к стенкам трубки и изолируют немоноцитарные клетки от раствора. Используйте пипетку объемом 25 миллилитров для удаления раствора, содержащего моноциты, из пробирки, стараясь при этом не касаться пипеткой стенок пробирки. После центрифугирования и удаления надосадочной жидкости повторно суспендировать гранулу, содержащую моноциты, в среде RPMI, содержащей 10% FBS без ТЕТ и 1% пен-стрептококка.

Анализ начинают с посева 40 000 клеток HCT-116 или MDA-MB-231 в объеме 0,5 миллилитра в лунки 24-луночного планшета в трех экземплярах. На следующий день добавьте в лунку фильтр. Затем поместите 8000 моноцитов в объеме 0,3 миллилитра на обработанную BSA пористую мембранную вставку, помещенную поверх раковых клеток, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Соберите вкладыши через 48 часов. Стряхните излишки среды и аккуратно проведите по внутренней поверхности аппликатором с ватным наконечником, чтобы удалить клетки, которые не мигрировали. Окрасьте внешнюю сторону вставки методом Райта-Гимзы.

После установки фильтров мигрировавшими макрофагами вверх визуализируйте предметные стекла с помощью светового микроскопа с объективом 20 степени. Сфотографируйте девять полей для каждого фильтра и подсчитайте мигрировавшие макрофаги во всех полях. Для количественной оценки миграции моноцитов к раковым клеткам был использован анализ камеры Бойдена.

В присутствии клеток рака молочной железы MDA-MB-231 миграция моноцитов была ингибирована на 33% после добавления доксициклина в кокультуру для подавления регуляции PAI-1. Это ингибирование миграции моноцитов было более выраженным в присутствии клеток рака толстой кишки HCT-116, где нокдаун PAI-1 при введении доксициклина снижал миграцию моноцитов на 74%. Аналогичные результаты наблюдались, когда среда для обработанных доксициклином раковых клеток была помещена на дно лунок в качестве источника хемоаттрактантов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать функциональную систему tet-on для нокдауна экспрессии генов в клеточных линиях рака человека для изучения хемоаттрактантного действия секретируемого белка PAI-1 ракового происхождения на моноциты человека.