Эффективным в Vitro транспонирования метод транскрипционно регулируемых Спящая красоты системой упакованы в дефектных лентивирусные вектор интеграции

Общая цель данного метода заключается в достижении устойчивой интеграции интересующего гена в геном первичных клеток человека с помощью транскрипционно регулируемой системы «Спящая красавица», упакованной в интеграцию дефектных лентивирусных векторов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генной терапии, такие как интеграция интересующего гена в первичные клетки с помощью системы Sleeping Beauty. Основным преимуществом этой методики является то, что индуцируемая гиперактивная система «Спящая красавица» эффективно доставляет первичные клетки, устойчивые к нескольким методам трансфекции.

Демонстрировать процедуру будет Даниэла Бенати, постдок в моей лаборатории. До дня трансдукции первичные кератиноциты человека выращиваются, как описано в текстовом протоколе. Чтобы отделить субсливающиеся кератиноциты в культуре, удалите среду, промойте клетки 1X PBS и добавьте по одному миллилитру предварительно подогретого рабочего раствора трипсина в каждую лунку.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут в инкубаторе для клеточных культур. Тщательно суспензируйте клетки лунки и переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку, содержащую два миллилитра сывороткосодержащей среды. Промойте лунку один раз тремя миллилитрами 1X PBS и добавьте промытый раствор в центрифужную пробирку с клеточной суспензией.

Центрифугируйте при 580-кратном g в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте клетки пятью миллилитрами 1X PBS, центрифугируйте при 580 умноженных g в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. В полипропиленовой трубке объемом 15 миллилитров разведите в 1,6 раза по 10 до пятой части кератиноциты в одном миллилитре среды CFAD.

Приготовьте по одному разведению для каждого состояния. Три вектора Integration Defective Lentiviral или IDLV были подготовлены ранее, как описано в текстовом протоколе. IDLVTKSB оснащен TET-регулируемыми гиперактивными транспонами SB100X.

IDLVrtTA кодирует модулятор, а IDLVT2 является носителем интересующего его гена. GFP в этом примере окружен транспозонными инвертированными повторами. Развести лентивирусные векторы в одном миллилитре среды CFAD в присутствии 20 микролитров полибрена, как указано в этой таблице.

Раз, два и три — отрицательные элементы управления без векторов. Четыре и пять содержат IDLVTKSB и IDLVrtTA. Шесть, семь, восемь и девять содержат все три лентивирусных вектора.

Трансдуцировать клетки в суспензии путем добавления каждого разведения лентивирусного вектора к соответствующей суспензии кератиноцитов. Удалите среду из смертельно облученных фидерных клеток 3T3-J2, которые отступили день назад, и наложите на них трансдуцированные кератиноциты. После исследования лунки приступайте к следующей.

Выдерживать при температуре 25 градусов в течение 30 минут. Затем перенесите клетки на 37 градусов на шесть часов. Через шесть часов добавьте по одному миллилитру среды CFAD в каждую лунку.

Добавьте по одному микромоляру доксициклина в пятую, восьмую и девятую лунки. Верните ячейки к 37 градусам Цельсия. Впоследствии обработайте клетки в каждой лунке так, как описано в текстовом протоколе.

Для цитофлуориметрического анализа трансдуцированные первичные кератиноциты, отделенные на третий и шестой день, должны быть отделены от фидерного слоя 3T3-J2 путем мечения клеток мышиным моноклональным конъюгированным антифидерным антителом APC. Приготовьте четыре миллилитра буфера для окрашивания для каждого образца, объединив 5% FBS, 500 миллимоляр ЭДТА и 1X PBS. Промойте оторвавшиеся клетки одним миллилитром буфера для окрашивания.

Центрифугируйте при 580-кратном g в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. В пробирке для получения проточной цитометрии ресуспендировать пять раз по 10 до четвертой клетки в 100 микролитрах окрашивающего буфера. Добавьте два микролитра антитела-антифидера в разведении один к 50 и хорошо перемешайте.

Инкубируйте на льду в темноте в течение 30 минут. Через 30 минут постирайте с двумя миллилитрами буфера для окрашивания. Центрифугируйте при 580 умноженных на g в течение пяти минут.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 200 микролитрах красящего буфера. Используйте проточный цитометр, сконфигурированный с синим лазером, красным лазером и фильтрами для обнаружения флуоресценции GFP и APC, чтобы получить сигналы APC и GFP. GFP-положительная клеточная фракция популяции APC-отрицательных клеток указывает на трансдуцированные кератиноциты.

Чтобы выполнить ПЦР в реальном времени, настройте реакции в трех экземплярах в 96-луночном планшете с конечным объемом реакции 25 микролитров. Каждая реакция содержит один микролитр кДНК, 12,5 микролитров мастер-смеси 2X, 1,25 микролитра праймеров в смеси зондов 20X и 10,25 микролитров стерильной воды. Запустите ПЦР в реальном времени в соответствии с этой программой ПЦР, один цикл при 95 градусах Цельсия в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95 градусах Цельсия в течение 15 секунд и 60 градусов Цельсия в течение одной минуты и удерживайте при температуре четыре градуса Цельсия.

Наконец, проанализируйте данные ПЦР в режиме реального времени, как описано в текстовом протоколе. Анализ экспрессии клеток HeLa, трансдуцированных с увеличением доз транспозов в векторах-модуляторах плюс-минус доксициклин, показал, что для сильной индуцирования экспрессии SB100X требуются высокие дозы обоих IDLV. Количественный анализ экспрессии SB100X на клетках HeLa, трансдуцированных транспонированным вектором в присутствии или отсутствии вектора-модулятора, выявил восьмикратную активацию на фоне в присутствии доксициклина.

Транскрипционно регулируемая система Sleeping Beauty также может быть использована в первичных клетках. Экспрессия SB100X на кератиноцитах, трансдуцированных с помощью транспозированных и модуляторных векторов, показала 15-кратную активацию по сравнению с выключенным состоянием. Эксперимент по транспозиции, проведенный в кератиноцитах, трансдуцированных тремя векторами IDLV плюс-минус доксициклин, показал, что 12% клеток, обработанных доксициклином, стабильно интегрировали по крайней мере одну копию GFP в свой геном.

После освоения жизненно важная трансдукция в первичных клетках может быть выполнена за восемь часов, цитофлуориметрический анализ — за два часа, а анализ экспрессии — за три часа, если все выполнено правильно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить об оптимизации комбинации векторных доз, используемых для трансдукции первичных клеток, и для достижения более высокого уровня экспрессии индуцируемых транспонов Sleeping Beauty. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как количественная ПЦР и линкер-опосредованная ПЦР, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как количество копий транспозона на клетку и интеграция для заполнения генома.

После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области генной терапии, чтобы изучить применение системы «Спящая красавица» в инженерии клинически значимых клеток. После просмотра видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как в первую очередь трансдуцировать первичные кератиноциты с помощью векторов IDLV. Во-вторых, измерьте экспрессию гиперактивных транспонов при условии доксициклина и, наконец, последуйте за транспозицией с помощью проточной цитометрии.

Не забывайте, что работа с вирусными векторами может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этих процедур всегда следует иметь при себе меры предосторожности, такие как BCL для сдерживания уровня и одноразового запаса.