Всеобъемлющей процедуры для оценки производительности в Vitro предполагаемый Гемангиобластома неоваскуляризация, используя сфероида прорастания Assay

Общей целью данного эксперимента является оценка эффективности предполагаемой неоваскуляризации гемангиобластомы с использованием анализа сфероидального прорастания in vitro. Метод может помочь ответить на ключевые вопросы в ангиогенной области, такие как ангиогенез опухолей. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является продуктом комплексной процедуры для оценки in vitro, где существует классический опухолевый ангиогенез при гемангиобластоме и он растет при гемангиобластоме.

Применение этого метода распространяется на терапию гемангиобластума и сосудистой системы, поскольку результат подчеркивает сложность неоваскуляризации гемангиобластума, и это позволяет предположить, что эта распространенная форма ангиогенеза является лишь дополнительным механизмом. Таким образом, этот метод может дать представление об изучении неоваскуляризации гемангиобластума. Он также может быть применен к опухолям, ангиогенезу и применению, связанному с васкулогенезом, при некоторых солидных опухолях, таких как васкулогенная мимикрия опухоли при стеклянной опухоли.

Реальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку создание этих манипулируемых сфероидов эндотелиальных клеток трудно изучить. Потому что важное значение имеют подходящие условия. Во-первых, культивировали эндотелиальные клетки HUVEC в культуральной среде DMEM с добавлением десятипроцентной фетальной бычьей сыворотки, пенициллина и стрептомицина.

Затем поддерживайте культуру в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с пятью процентами углекислого газа. Далее, чтобы синтезировать фрагмент шРНК, расщепляют плазмиду с помощью ферментов рестрикции ApaI и EcoRI. Затем к переваренной плазмиде добавьте как прямые, так и обратные олигону, 10-кратный буфер NEB и двойную дистиллированную воду до конечного объема 50 микролитров.

После добавления всех реагентов нагрейте смесь до 98 градусов Цельсия в течение четырех минут. Затем постепенно охладите до комнатной температуры в течение нескольких часов. Используйте Т4-лигазу для лигирования отожженных олигонотидов и плазмиды.

Инкубируйте трубку при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На следующий день добавьте пять микролитров смеси для лигирования к 25 микролитрам DH5alpha-компетентных клеток. В 500 микролитров среды DMEM добавьте лентивирусный вектор или скремблированный вектор вместе с другими упаковочными плазмидами.

Затем инкубируйте чечевичную смесь в течение 25 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации добавьте 7 миллилитров среды DMEM в омлет или чечевичную смесь. Культивируйте клетки 293FT в среде DMEM без фетальной бычьей сыворотки в 10-сантиметровой чашке для культивирования.

Добавьте один миллилитр лентивирусного или омлетного раствора к клеткам размером 293 фута в чашке для культивирования. Через шесть часов отсадите старую среду из чашки для культуры. Затем замените старую среду свежей средой DMEM, содержащей 10 процентов фетальной бычьей сыворотки.

Через 48 часов соберите среду. Перенесите эндотелиальные клетки HUVEC в лентивирусную среду и выдержите в течение 72 часов. Далее добавьте два микрограмма на миллилитр пуромицина в среду для культивирования клеток HUVEC.

Наконец, инкубируйте культуру еще 24 часа. На следующий день добавьте один миллилитр трипсина ЭДТА, чтобы трипсинизировать клетки HUVEC. Затем ресуспендированную суспензию трипсинизированных клеток в среде DMEM с 10-процентной фетальной бычьей сывороткой.

Подсчитайте количество ячеек с помощью счетчика ячеек. После подсчета засейте клетки в 96-луночный планшет с круглым дном. После посева инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с пятипроцентным содержанием углекислого газа в течение 72 часов непрерывно.

Через 36 часов замените половину питательной среды свежей средой. Сначала разморозьте раствор геля при температуре четыре градуса Цельсия, а затем разведите его в соотношении один к пяти с восстановленной сывороткой среды. Отсосите сфероиды из среды DMEM с помощью микропипетки.

Далее промойте сфероиды пятью миллилитрами восстановленной сыворотки среды. Осторожно перенесите взвешенные сфероиды и разведенный гель. В 15-луночный планшет влейте 300 микролитров смешанной жидкости из сфероидов и разведенного геля.

Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах углекислого газа в течение одного часа. Далее добавьте 400 микролитров восстановленной сыворотки среды в одну лунку. Чтобы предотвратить испарение, заполните окружение колодца стерильной водой.

Затем культивируйте клетки при температуре 37 градусов по Цельсию, пяти процентах углекислого газа и 100-процентной влажности в течение часа. После инкубации аспирируйте старую среду и добавьте в лунку 600 микролитров восстановленной сывороточной среды с однопроцентной добавкой для роста эндотелиальных клеток и инкубируйте в течение суток. Делайте снимки с помощью микроскопа с инвертированным светом.

Здесь сфероидное прорастание клеток фиксируется с помощью микроскопа инвертированного света для изучения влияния сайленсинга гена VHL на ангиогенный потенциал эндотелиальных клеток. Наблюдается, как сфероид прорастает через 12 часов после лентивирусной обработки как в контрольных, так и в глушитых эндотелиальных клетках VHL. Затем проводится статистический анализ для количественной оценки длины ростков, генерируемых сфероидами с глушителем гена VHL.

Средняя длина ростка, по-видимому, составляет около 125 микрометров в группах с тишиной VHL, в то время как в контрольной группе она составляет всего около 65 микрометров. Средняя совокупная длина ростков в группе с глушителем VHL составляет около 1250 микрометров, в то время как в контрольной группе — 680 микрометров. Эти результаты указывают на двукратное увеличение длины ростков в группах с глушителем VHL.

После освоения этой техники ее можно выполнить за 48 часов, если она выполнена правильно. Следуя этой процедуре и методу, можно провести анализ капиллярного образования, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, исследование ангиогенной способности эндотелиальных клеток сосудов.

После этого развития этот метод проложил путь исследователям в области ангиогенеза к изучению внутренней васкулоризации опухоли. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, какие гены теряют функцию в манипулируемых эндотелиальных клетках, используемых для взрывного анализа.