Perfusable сосудистая сеть с моделью ткани в устройстве Microfluidic

Общая цель этой процедуры заключается в использовании микрофлюидной платформы для создания перфузионной сосудистой сети в многоклеточном агрегате, или сфероиде. Этот метод может помочь решить ключевые вопросы в альтернативной форме областей регенеративной медицины, например, насколько важна сосудистая сеть в моделях тканей in vivo и in vitro. Основное преимущество этой методики заключается в том, что путь введения лекарственного препарата и добавки может быть смоделирован in vitro путем доставки интересующих областей непосредственно в сфероиды.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за трудностей с введением клеток в целевую область в микрофлюидном устройстве. После литья преполимера PDMS дегазируйте материал в вакуумной камере в течение двух часов, а затем отверждайте в течение ночи при температуре 80 градусов Цельсия в духовке с вентиляцией воздуха. На следующее утро отделите PDMS от кремниевой пластины и с помощью дырокола диаметром два миллиметра создайте отверстия в материале в указанных местах.

Используйте перфоратор диаметром один миллиметр, чтобы создать сфероидальную лунку, и используйте клейкую ленту для очистки плиты PDMS и стеклянной крышки размером 24 на 24 миллиметра. Обработайте чистую плиту воздушной плазмой в течение 40 секунд и приклейте плиту PDMS к покровному листу. Затем отверждайте PDMS при температуре 80 градусов Цельсия в течение не менее 12 часов.

За два-три дня до посева микрофлюидного устройства добавьте трижды по 10 к пятому только что размороженному hLF, RFP-HUVEC и GFP-HUVECs в 10 миллилитров свежей эндотелиальной среды в 10-миллиметровой посуде. Когда hLF и RFP-HUVEC достигают субконфлюенции, суспендируйте hLF и RFP-HUVEC в эндотелиальной среде до конечных концентраций в 1,0 х 10 к пятой и 2,5 х 10 к четвертой клетке на миллиметр соответственно. После двух суток в суспензионном культуре, в шкафу биобезопасности, добавьте в центр 35-миллиметровой чашки Петри на льду каплю свежеприготовленного мастер-микса объемом 99 микролитров.

Чтобы загрузить микрофлюидное устройство, используйте модифицированный наконечник микропипетки объемом 100 микролитров, чтобы перенести сфероид и 100 микролитров среды во вторую чашку Петри комнатной температуры. Затем втяните сфероид в минимальное количество среды и поверните пипетку вертикально так, чтобы сфероид перемещался к нижней части кончика пипетки под действием силы тяжести. Прикоснитесь наконечником пипетки к мениску основной капли смеси, чтобы вытолкнуть сфероид в раствор, не нажимая на поршень пипетки.

Далее быстро добавьте в каплю один микролитр свежеприготовленного тромбина, и аккуратно вмешайте тромбин в раствор. Установив дозатор на семь микролитров, медленно перенесите сфероид в сфероидальную лунку пластины PDMS. Наиболее важным этапом процедуры является введение в сфероид достаточного количества геля, чтобы сфероид мог осесть в нижней части устройства.

После загрузки аккуратно снимите наконечник пипетки, чтобы предотвратить утечку между микроконтактами. Инкубируйте сфероид при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Когда фибрин затвердеет, медленно введите от 20 до 30 микролитров эндотелиальной среды в отверстия один А и три А, чтобы загрузить каналы один и три соответственно.

Затем переложите устройство на влажную лабораторную салфетку в 100-миллиметровой чашке и инкубируйте устройство при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение 24 часов, чтобы облегчить удаление любых пузырьков на границе между средой и фибрином. На следующий день добавьте два миллилитра 0,05% трипсина-ЭДТА к суб-слиянию GFP-HUVEC и остановите реакцию трипсина четырьмя миллилитрами полной среды, когда клетки полностью отделятся. Соберите эндотелиальные клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в свежей эндотелиальной среде в концентрации от пяти до 10 до 10 до 6 клеток на миллилитр.

Затем введите 20 микролитров HUVEC в отверстие 1 B для загрузки первого канала и поместите устройство при температуре 37 градусов Цельсия на 30 минут, наклонив его под углом 90 градусов, чтобы убедиться, что HUVEC прилипают к фибрину во втором канале. После загрузки третьего канала таким же образом поместите устройство в новую 100-миллиметровую чашку, содержащую влажную лабораторную салфетку, в инкубатор для клеточных культур на 7-14 дней, ежедневно заменяя половину среды в первом и третьем каналах. На этих репрезентативных изображениях, сделанных в нулевой день загрузки HUVEC, видно, что фибриновый гель загружен только во второй канал, без какой-либо утечки в первый или третий каналы, и с HUVEC, успешно прикрепленными к боковой стенке фибринового геля.

Также можно наблюдать, как сфероид правильно расположен в нижней части устройства. Ангиогенные ростки наблюдаются с первого дня, причем самый длинный росток достигает сфероида на третий день в этом эксперименте, а большинство ангиогенных ростков достигают сфероида к седьмому дню. Оптимально, после четырех дней пребывания в аппарате, можно наблюдать кровоток через сосудистые просветы с сосудистым углом, определяемым как направление сосудистого кончика и центра сфероида от сосудистого корня.

Сосудистые углы уменьшаются во времени в зависимости от времени, что указывает на миграцию ангиогенных ростков к сфероиду. RFP и GFP-HUVEC могут координировать формирование единого сосудистого просвета, что ясно указывает на то, как ангиогенные проростки из первого и третьего каналов анастомозы в RFP-HUVEC в сфероиде образуют непрерывную сосудистую сеть. Кроме того, ФИТК-декстран, введенный в первый канал, поступает в сконструированную сосудистую сеть и внутреннюю часть сфероида, в конечном итоге достигая третьего канала, подразумевая, что интегрированная сосудистая сеть может снабжать сфероид питательными веществами и удалять продукты его жизнедеятельности.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области органического электричества к изучению эффективности лекарств или добавок, представляющих интерес, в моделях тканей in vitro.