Реконфигурируемые Microfluidic канал с Pin дискретизированы бортами

Общая цель этой процедуры заключается в изготовлении реконфигурируемого микрофлюидного устройства с боковыми стенками, состоящими из массива контактов. Основным преимуществом этого микрофлюидного устройства является его способность работать с труднодоступными объектами и ситуациями, которые могут быть неизвестны на этапе проектирования канала. Как правило, новичкам в этом методе будет трудно вытравить крошечные булавки в форме костей собаки.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как сборку многих микрофлюидных деталей и монтаж их на основании трудно изучить только по письменному протоколу. На этой фотографии изображено готовое микрофлюидное устройство с реконфигурируемым каналом. Здесь реконфигурируемая часть находится в верхней части изображения.

На схеме разнесенного вида видятся некоторые из его основных компонентов. В частности, обратите внимание на микроканал и контакты, используемые для его перенастройки. В качестве первого шага протравите булавки.

Начните с обезжиренных L-образных штифтов из нержавеющей стали разной длины толщиной 0,3 миллиметра. Имейте готовые четыре миллилитра 10%-ной азотной кислоты, и погружайте в нее булавки. Затем поместите контейнер в духовку с температурой 65 градусов Цельсия на 30 минут.

После извлечения штифтов перенесите их пинцетом один за другим в емкость с деионизированной водой. Далее проработайте их ультразвуком в воде в течение пяти минут. Когда все будет готово, высушите их бумажным полотенцем.

Имейте готовое 0,5 миллилитра разделительного средства для пресс-формы, и погружайте в него штифты. Через два часа поместите штифты в деионизированную воду и обрабатывайте их ультразвуком в течение пяти минут. Для продолжения требуется форма для травли.

Тарелка для травления изготовлена из стекла и силиконового клея. Начните процесс травления с нанесения силиконового клея на концы булавок на блюде. Расположите штифты так, чтобы кончики на их прямых концах были погружены в клей.

Это блюдо после того, как все штифты будут на месте и готовы к следующему шагу. Переложите форму для травления во увлажненную ферментерку, нагретую до 38 градусов Цельсия, и подождите ночь, чтобы клей застыл. Когда она будет готова, поставьте форму для травления булавками на конфорку с температурой 65 градусов Цельсия.

Налейте 0,8 миллилитра травляющей кислоты на непокрытую область штифтов. Через 10 минут переложите кислоту в стакан с помощью микропипетки. Затем добавьте в блюдо еще кислоты для травления, чтобы повторить этап травления.

После травления проверьте, чтобы ширина протравленного участка составляла около 0,2 миллиметра. Если это так, нанесите микропипеткой пять миллилитров раствора гидрокарбоната натрия на протравливающую чашку, чтобы нейтрализовать оставшуюся кислоту. Затем с помощью пинцета удалите штифты, потянув их в продольном направлении.

Начните с готовой формы. Как и на этой схеме, пресс-форма предназначена для устройства с неподвижной боковой стенкой и местом для штифтов. Создайте форму на предметном стекле с помощью литографии.

Подготовленную горку выложите на дно пластиковой посуды. Теперь залейте преполимер PDMS на форму толщиной три миллиметра. Поместите форму в вакуумный эксикатор на 10 минут.

После этого переместите его в духовку при температуре 65 градусов Цельсия на один час. В результате получается частично отвержденная плита. Используйте скальпель, чтобы снять плиту для следующих шагов.

Поместите плиту в духовку при температуре 120 градусов Цельсия на час для полного отверждения. Теперь работайте с полностью отвержденной плитой. Он будет иметь неровные края вдоль направляющей линии.

Используйте скальпель, чтобы точно и чисто обрезать неровные края. Уделите особое внимание поверхности для вставки штырьков, чтобы создать наилучшее устройство. Перфорируйте отверстия на входе/выходе из основной камеры и в других местах с помощью пуансонов для биопсии.

Теперь изготовьте узел микроканала. Нагрейте чистящий раствор до 60 градусов Цельсия и получите покровное стекло под номером четыре. Покровное стекло имеет размеры 10 на 20 миллиметров.

Погрузите покровное стекло в раствор на 10 минут. Поместите промытое и высушенное покровное стекло и пластину PDMS на нижний электрод распылительной коатеральной машины. Генерируйте воздушно-вакуумную плазму в течение 30 секунд.

Соедините извлеченный элемент так, чтобы края выровнялись, а элементы канала были видны через покровное стекло. Используйте стерильный контейнер, чтобы отнести склеенные слои к ламинарному колпаку для их стерилизации. Когда закончите, вставьте контакты в слот.

Соседние кегли должны быть разной длины. Штифты образуют другую боковую стенку микрокамеры. Продолжайте работу в ламинарном капюшоне.

Для следующих шагов подготовьте основание для устройства. Приготовьте заполнитель зазоров путем гомогенизации смеси белого вазелина и порошка политетрафторэтилена. Налейте гомогенизированную смесь в шприц-дозатор и вставьте поршень.

Нажмите на поршень, чтобы заполнить кончик шприца. Затем прикрепите иглу и нажимайте на поршень, пока игла не заполнится. Аналогичным образом приготовьте второй шприц с силиконовым клеем и подсоедините каждый к пневматическому дозатору.

Теперь нанесите силиконовый клей на основание. Положите его вдоль одного из карманов. Затем поместите покровное стекло под номером четыре в карман и плотно прижмите его, чтобы приклеить.

Затем распределите силиконовый клей по двум внешним прорезям основания, нарисовав сегменты глубиной около одного миллиметра. Вдоль еще одной прорези посередине распределите заполнитель зазоров в сегменте глубиной один миллиметр. Нанесите еще клея на край другого кармана.

Поместите микроканальный узел на карман и плотно прижмите его. Еще раз положите заполнитель зазоров в прорезь по середине основания. После этого нанесите клей на соседние прорези.

Дайте устройству постоять одни сутки в стерильной вытяжке. После отверждения, в ламинарном колпаке, переместите каждый штифт на расстояние до одного миллиметра вдоль соседних штифтов, чтобы освободить их от эластомерного барьера. Настройте флуоресцентный тест на утечку, разбавив зеленый флуоресцентный краситель в ионизированной воде.

Затем откройте микроканал, чтобы получить одинаковую ширину по всей длине. С помощью микропипетки перенесите краситель в один из конечных портов микроканала, и заполните его раствором. В большую пластиковую посуду поместите два листа впитывающей бумаги, смоченных деионизированной водой, и внутрь устройство.

Инкубируйте блюдо в 5% углекислом газе не менее 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Просмотрите извлеченное устройство с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа и запишите изображения. Используйте их, чтобы убедиться в отсутствии утечки вокруг контактов.

На этих изображениях изображен протекающий и непротекающий образец. Еще одно испытание связано с засевом клеток. Откройте микроканал, чтобы получился прямой канал шириной 400 микрон с максимально плоской боковой стенкой.

Добавьте суспензию ячеек к одному из конечных портов, чтобы заполнить канал. Найдите контакты, определяющие боковую стенку области, чтобы начать культивирование клеток, и закройте их, чтобы закрыть клетки в этой области. Начиная с области, закройте все контакты, чтобы вытеснить ячейки в канале.

После откачки суспензии из торцевых отверстий добавьте среднюю. Поместите устройство в пластиковый контейнер с влажной впитывающей бумагой. Инкубируйте его не менее 24 часов.

Следите за тем, чтобы в закрытом помещении было около 10 ячеек на каждую. Затем медленно втяните штифт, чтобы расширить зону культивирования. На этих изображениях изображены клетки COS-7, выращенные в реконфигурируемом микроканале.

В течение девяти дней была расширена зона микроканального культивирования. Собранные данные позволяют построить график количества и плотности клеток в зависимости от времени. Синие точки и аппроксимация кривой предназначены для подсчета ячеек.

Красные символы и подгонки предназначены для плотности. Для плотности вертикальные стрелки указывают на расширение области клеточной культуры через два, пять и шесть дней. Плотности рассчитываются для одних и тех же площадей культивирования.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как из небольших штифтов соорудить негерметичную боковую стенку микрофлюидного канала. После освоения этой техники ее можно сделать за одну неделю, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно тщательно и тщательно выполнять каждый из этапов протокола.

Не забывайте, что работа с сильной кислотой может быть чрезвычайно опасной, поэтому всегда следует принимать меры предосторожности, такие как приготовление достаточного количества нейтрализующего средства. После этих процедур можно вводить другие клетки с жидкостью для создания более сложных клеточных культур.