Порядок Создание многоуровневой углубленным круглым сечением Endothelialized Микроканалы-на-чипе

Общая цель этой процедуры заключается в разработке микроканалов многоуровневого кругового поперечного сечения эндотелиальных жизней на чипе, который имитирует 3D-геометрию микрососудов in vivo и протекает в контролируемом непрерывном потоке обильности. Это достигается путем первого фотолитографического изготовления мастер-формы с полукруглой сетью микроканалов поперечного сечения с использованием положительного оплавляемого фоторезиста. Второй шаг заключается в использовании мастер-формы для репликации двух микроканалов поли-диметилсоана, их выравнивания и соединения для создания цилиндрической сети микроканалов.

Затем первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека помещаются внутри микроканальной сети перед культивированием клеток в условиях контролируемой непрерывной перфузии среды в течение периода времени от четырех дней до двух недель. В конечном счете, вдоль внутренней поверхности микроканальной сети разрабатывается монослой слияния клеток, обозначенный мембранным положением и ядрами, находящимися под микроскопами. Тем не менее, обычные анализы отдельных микрососудов, такие как анализы миграции ансо-клеток и два анализа образования, а также анализ правого и мостика-кольца, ограничены воссозданием отдельных микрососудов в отношении трехмерной геометрии и непрерывного контроля потока.

Основное преимущество наших методов, нашего существующего метода микропроизводства, заключается в том, что он может традиционно изготовить сеть микрофлюидных каналов с несколькими глубинами, которая имитирует сложную 3D-геометрию микрососудов in vivo с округлыми поперечными сечениями. Это также позволяет проектировать микрососудистые биомагнитные системы, которые примерно подчиняются более медленно и поддерживают поток жидкости на необходимом уровне, чтобы общая резистентность канала была низкой, а поток, который мы потеряли, был более равномерным по всей сети, демонстрируя процедуру аспирантом из моей лаборатории. Эта процедура начинается с изготовления мастер-формы для фоторезиста, состоящей из микроканалов диаметром от 30 до 60 микрон, как подробно описано в текстовом протоколе, кратковременного переноса фоторезиста оплавлением из холодильника при температуре четыре градуса Цельсия в чистую комнату за 24 часа до использования и предоставления ему нагреться до комнатной температуры.

Начните с нанесения слоя фоторезиста с положительным оплавлением на предварительно очищенную кремниевую подложку в соответствии с процедурой, описанной в текстовом протоколе. Затем подвергните фоторезист воздействию ультрафиолетового излучения через узорчатую маску перед проявкой узорчатых микроканалов. Наконец, после оплавления создайте полукруглую сеть микроканалов поперечного сечения.

Как только мастер-форма будет готова, приготовьте раствор полиметилсоана или PDMS в массовом соотношении 10 к одному основанию к отвердителю и тщательно перемешайте его с помощью планетарного центробежного миксера. Отлите раствор PDMS на оплавленную фоторезистную мастер-форму. Поместите литую PDMS в дегаситель на 15 минут, чтобы Дега.

При необходимости используйте газообразный азот для удаления оставшихся пузырьков. Выпекайте PDMS в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение трех часов, чтобы дать ему застыть. Затем снимите отвержденный слой PDMS с мастер-формы.

Используйте заточенный дырокол для создания входных и выходных отверстий путем пробивания отверстий в сети каналов. Очистите поверхность PDMS с помощью газообразного азота. Обработайте два слоя PDMS кислородной плазмой в течение 30 секунд внутри плазменного очистителя при рабочем давлении 45 миллионов и расходе кислорода 3,5 кубических фута в минуту.

Затем юстируют поверхности PDMS вручную под оптическим микроскопом. При необходимости используйте каплю воды для лучшего контроля выравнивания. Наконец, запекайте устройство в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы добиться постоянного склеивания культуры.

Первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека или ЖЭ в культуральной среде с L-глютамином с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Обработайте аппарат кислородной плазмой в течение пяти минут с рабочим давлением 45 мц и скоростью потока кислорода 3,5 кубических фута в минуту. Затем загрузите устройство деионизированной водой и обработайте ультрафиолетовым светом в течение восьми часов в ламинарном биозащитном колпаке для стерилизации.

За день до того, как клетки будут готовы, промойте устройство одним x фосфатно-соевым буфером или PBS, а затем покройте фибронектином. Выдерживать в холодильнике при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. После того, как клетки сливаются, соберите их, сначала промыв клетки буферным солевым раствором, а затем обработав клетки трипсином ЭДТА после добавления трипсина.

Инкубируйте клетки в течение двух-шести минут при температуре 37 градусов Цельсия. После того, как трипсин будет завершен, нейтрализуйте трипсин ЭДТА нейтрализующим раствором трипсина. Подсчитайте клетки, затем центрифугируйте их перед реанимацией.

Суспендирование в культуральной среде 8% декстрином используется для повышения вязкости среды, чтобы способствовать лучшему прилеганию и прикреплению клеток после нанесения покрытия FI enc ENC. Промойте устройство одним XPBS, затем загрузите устройство питательной средой перед инкубацией при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. Далее в устройство загружают клетки в культуральную среду с 8% декстрином в концентрации от трех до 4 миллионов клеток на миллилитр.

Поместите каплю клеток объемом 20 микролитров на одно из входных отверстий устройства и наклоните ее, чтобы ввести клетки в микрофлюидный канал. Через 15 – 20 минут клетки начнут прикрепляться к боковым стенкам каналов. Поворачивайте устройство каждые 15 минут, чтобы создать более равномерное распределение ячеек.

При необходимости может быть выполнена дополнительная погрузка. После пяти-шести часов статического культивирования прикрепленные клетки начнут полностью распространяться. Настройте долгосрочную перфузию с помощью дистанционно управляемой системы шприцевого насоса с постоянным потоком 10 микролитров в час, перфузия может быть отрегулирована для более высокой скорости потока и может длиться в течение периода времени от четырех дней до двух недель.

Когда клетки достигнут слияния внутри устройства, сначала промойте устройство одним XPBS, чтобы тщательно удалить среду. Затем загрузите в прибор разведенный красный краситель после инкубации прибора в темноте в течение пяти минут при комнатной температуре. Промойте его питательной средой, чтобы остановить окрашивание.

Длительная инкубация красителя может вызвать клеточную токсичность и нарушение адгезии. Затем загрузить устройство синим красителем, разведенным одним XPBS, инкубировать в темноте в течение пяти минут при комнатной температуре, перед тем как тщательно промыть устройство одним XPBS. Рассмотрите окрашивание клеток под инвертированным оптическим микроскопом.

Если окрашивание хорошее, загрузите микроканалы фиксирующим средством, затем погрузите прибор в фиксирующий материал и полностью накройте его алюминиевой фольгой. Храните устройство в холодильнике при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы предотвратить высыхание устройства и обесцвечивание Неподвижное устройство теперь готово к конфокальной визуализации, которую можно сделать с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, сканирующей электронной микроскопии и оптической микроскопии. Были использованы для характеристики фоторезиста оплавления и реплицированного канала PDMS до и после выполнения оплавления.

В статье охарактеризованы и показаны геометрические особенности микроканальной сети PDMS. Круглые поперечные сечения пресс-форм PDMS показывают размеры канала на каждом уровне ветвления. Результаты показывают, что метод фоторезистного оплавления может создавать многоуровневые разветвляющиеся сети каналов в более удобном подходе с помощью методов фоторезистного оплавления и позволяет проектировать микрососудистые биомиметические системы, которые примерно подчиняются закону Мюррея, показанному здесь микроскопическим изображениям с использованием флуоресцентного клеточного мембранного красителя красного цвета и клеточного ядерного красителя синего цвета.

Круговое поперечное сечение показало, что VE выстилает внутреннюю поверхность цилиндрической микроканальной сети в различных областях ветвления. Из-за сложной геометрии микрососудистой сети in vivo мониторинг этих мелких сосудов в режиме реального времени затруднен. Разработанный чип на основе P DM S обладает хорошими оптическими свойствами и позволяет получать высококачественную визуализацию эндотелиальных микроканалов в режиме реального времени, как показано на этом конфокальном фильме о клеточной выстилке вдоль сети кольцевых каналов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изготовить оплавление для этого массового режима. Создайте микроканальную сеть PDMS круглого сечения, загрузите эндоклеточные клетки в устройства и настройте долгосрочное изобилие среды. Таким образом, разработанная эндосериализованная микроканализация на чипе обеспечивает быстрый и воспроизводимый подход к созданию микроканальных сетей с круговым поперечным сечением и несколькими глубинами, которые имитируют геометрию микрососудов InVivo.

Эта процедура иллюстрирует использование уникальных возможностей в передовых технологиях микропроизводства и микропитания для создания микрососудистой модели с долгосрочным непрерывным контролем перфузии, а также высокого качества и возможности визуализации в реальном времени с растущей полезностью микропищевых каналов для клеточной биологии, тканевой инженерии и биоинженерии. Эндосериализованные микроканалы на чипе представляют собой потенциальное эссе для исследования микрососудов.