Порядок Создание многоуровневой углубленным круглым сечением Endothelialized Микроканалы-на-чипе

Общая цель данной процедуры заключается в разработке чипа с эндотелиализированными микроканалами круглого сечения различной глубины, который имитирует 3D-геометрию микрососудов in vivo и работает в условиях контролируемого непрерывного перфузионного потока. Это достигается путем первоначального фотолитографического изготовления основной формы с сетью микроканалов полукруглого сечения с использованием позитивного перетекающего фоторезиста. На втором этапе основная форма используется для репликации двух полидиметилсилоксановых микроканалов, которые затем совмещаются и склеиваются для создания цилиндрической сети микроканалов.

Затем первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека высевают в сеть микроканалов, после чего клетки культивируют в условиях контролируемой непрерывной перфузии среды в течение периода от четырех дней до двух недель. В итоге вдоль внутренней поверхности сети микроканалов формируется сливный клеточный монослой, что подтверждается визуализацией мембран и ядер под микроскопом, создавая функциональные микрососуды, которые могут служить платформой для изучения сложных сосудистых явлений. Однако традиционные методы анализа отдельных микрососудов, такие как тесты на миграцию клеток, тесты на формирование трубок и тесты с эксплантатами сосудистого кольца, имеют ограничения в воссоздании индивидуальных микрососудов с точки зрения трехмерной геометрии и контроля непрерывного потока.

Основным преимуществом наших методов, в частности существующего способа микрофабрикации, является возможность традиционного изготовления многоуровневой сети микрофлюидных каналов, которая имитирует сложные трехмерные геометрии микрососудов in vivo с округлым поперечным сечением. Это также позволяет проектировать микрососудистые биомагнитные системы, которые приблизительно соблюдают более медленное течение и поддерживают поток жидкости на требуемом уровне, чтобы общее сопротивление каналов оставалось низким, а поток распределялся более равномерно по всей сети; процедуру продемонстрирует аспирант моей лаборатории. Данная процедура начинается с изготовления мастер-формы из фоторезиста, состоящей из микроканалов диаметром от 30 microns до 60 microns, как подробно описано в текстовом протоколе; кратко: за 24 часа до использования перенесите фоторезист для рефлоу из холодильника с температурой 4 °C в чистое помещение и дайте ему прогреться до комнатной температуры.

Начните с нанесения слоя позитивного фоторезиста методом центрифугирования на предварительно очищенную кремниевую подложку согласно процедуре, описанной в текстовом протоколе. Затем подвергните фоторезист воздействию УФ-излучения через маску с рисунком перед проявлением микроканалов заданной конфигурации. В завершение, после процесса оплавления, сформируйте сеть микроканалов с полукруглым поперечным сечением.

После того как мастер-форма будет готова, приготовьте раствор полиметилсилоксана или PDMS, соблюдая весовое соотношение основы к отвердителю 10:1, и тщательно перемешайте его с помощью планетарного центробежного миксера. Залейте раствор PDMS на мастер-форму с оплавленным фоторезистом. Поместите залитый PDMS в эксикатор на 15 минут для дегазации.

При необходимости используйте газообразный азот для удаления оставшихся пузырьков. Поместите PDMS в печь при температуре 60 °C на три часа для полимеризации. Затем снимите отвержденный слой PDMS с мастер-формы.

Используйте заостренный пробойник, чтобы создать входные и выходные отверстия, пробив их в сети каналов. Очистите поверхность PDMS струей азота. Обработайте два слоя PDMS кислородной плазмой в течение 30 секунд в установке для плазменной очистки при рабочем давлении 45 milato и скорости потока кислорода 3,5 cubic feet per minute.

Затем вручную совместите поверхности PDMS под оптическим микроскопом. При необходимости используйте каплю воды для более точного контроля совмещения. В завершение поместите устройство в печь при 60 °C на 30 минут для обеспечения постоянного склеивания.

Первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека или VE в культуральной среде с L-глутамином, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой. Обработайте устройство кислородной плазмой в течение пяти минут при рабочем давлении 45 milit и скорости потока кислорода 3,5 cubic feet per minute. Затем заполните устройство деионизированной водой и подвергните воздействию УФ-излучения в течение восьми часов в ламинарном боксе биологической безопасности для стерилизации.

За один день до готовности клеток промойте устройство 1x фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), а затем покройте его фибронектином. Инкубируйте в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи. После достижения клетками конфлюэнтности соберите их, предварительно промыв клетки буферным раствором HEPES, а затем обработав их трипсином-ЭДТА после добавления трипсина.

Инкубируйте клетки в течение двух-шести минут при 37 °C. После завершения трипсинизации нейтрализуйте трипсин-ЭДТА с помощью нейтрализующего раствора трипсина. Подсчитайте количество клеток, затем центрифугируйте их перед ресуспендированием.

Суспендирование в культуральной среде с 8% декстрином используется для повышения вязкости среды, что способствует более эффективному осаждению и прикреплению клеток после нанесения покрытия FI enc ENC. Промойте устройство одним объемом XPBS, затем заполните его культуральной средой перед инкубацией при температуре 37 °C в течение 15 минут. Затем в устройство вносят клетки в культуральной среде с 8% декстрином при концентрации от 3 до 4 миллионов клеток на мл.

Поместите каплю клеток объемом 20 µL в одно из входных отверстий устройства и наклоните его, чтобы ввести клетки в микрофлюидный канал. Через 15–20 минут клетки начнут прикрепляться к боковым стенкам каналов. Поворачивайте устройство каждые 15 минут для создания более равномерного распределения клеток.

При необходимости можно провести дополнительный посев. После пяти-шести часов статического культивирования прикрепившиеся клетки начнут полностью распластываться. Организуйте длительную перфузию с использованием системы с дистанционно управляемым шприцевым насосом при постоянном потоке 10 µl в час; скорость перфузии может быть увеличена, а сама процедура может длиться от четырех дней до двух недель.

Когда клетки внутри устройства достигнут конфлюэнтности, сначала промойте устройство одним объемом XPBS, чтобы полностью удалить среду. Затем заполните устройство разведенным красным красителем и инкубируйте устройство в темноте в течение пяти минут при комнатной температуре. Промойте устройство культуральной средой, чтобы остановить окрашивание.

Длительная инкубация с красителем может вызвать цитотоксичность и нарушение адгезии клеток. Затем заполните устройство синим красителем, разведенным в 1×PBS, и инкубируйте в темноте в течение пяти минут при комнатной температуре, после чего тщательно промойте устройство 1×PBS. Оцените окрашивание клеток с помощью инвертированного оптического микроскопа.

Если окрашивание прошло успешно, заполните микроканалы фиксирующей средой, затем погрузите устройство в фиксирующую среду и полностью накройте его алюминиевой фольгой. Храните устройство в холодильнике при температуре четырех градусов Цельсия, чтобы предотвратить высыхание и выцветание. Теперь зафиксированное устройство готово к конфокальной визуализации, которая может быть выполнена с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа, сканирующей электронной микроскопии и оптической микроскопии. Эти методы использовались для характеристики фоторезиста после оплавления и реплицированного канала из PDMS до и после процесса оплавления.

Здесь представлены и охарактеризованы геометрические особенности сети микроканалов из PDMS. Круговые сечения форм из PDMS демонстрируют размеры каналов на каждом уровне ветвления. Результаты показывают, что метод оплавления фоторезиста позволяет более удобным способом создавать разветвленные сети каналов различной глубины и проектировать биомиметические микрососудистые системы, которые примерно соответствуют закону Мюррея; здесь представлены микрофотографии с использованием красного красителя для клеточных мембран и синего красителя для клеточных ядер.

Виды в поперечном сечении показали, что эндотелий сосудов (VE) выстилает внутреннюю поверхность сети цилиндрических микроканалов в различных областях ветвления. Из-за сложной геометрии микрососудов in vivo мониторинг этих мелких сосудов в режиме реального времени затруднен. Разработанный чип на основе PDMS обладает хорошими оптическими свойствами и позволяет получать высококачественные изображения эндотелиальных микроканалов в режиме реального времени, что показано на данном конфокальном видео с изображением клеточного слоя вдоль сети круговых каналов.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как изготовить систему микрофлюиды для данного режима. Создайте сеть микроканалов из PDMS с круглой формой поперечного сечения, загрузите эндотелиальные клетки в устройства и настройте длительную перфузию среды. Резюмируя, разработанные серифицированные микроканалы для эндотелия на чипе обеспечивают быстрый и воспроизводимый способ создания многоглубинных сетей микроканалов с круглым поперечным сечением, которые имитируют геометрию микрососудов InVivo.

В данной процедуре демонстрируется использование уникальных возможностей передового микропроизводства и микрофлюидных технологий для создания микрососудистой модели с возможностью долгосрочного непрерывного контроля перфузии, а также высококачественной визуализации в режиме реального времени, что подчеркивает растущую значимость микрофлюидных каналов для клеточной биологии, тканевой инженерии и биоинженерных приложений. Чип с последовательными эндотелизированными микроканалами представляет собой перспективную платформу для микрососудистых исследований.