Адаптация микроэлектродные массив технологий для изучения анестезии индуцированной нейротоксичности в мозге нетронутыми Пятачок

Общая цель этой экспериментальной процедуры заключается в использовании нового применения технологии микроэлектродной матрицы на основе ферментов для измерения нейротрансмиттеров у новорожденных поросят. В этом примере активность глутамата in vivo исследуется для изучения нейротоксичности, вызванной анестезией. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет измерять активность нейротрансмиттеров in vivo с исключительным пространственным и временным разрешением в клинически значимой животной модели нейротоксичности, вызванной анестезией.

Хотя этот метод может дать представление о механизмах нейротоксичности, вызванной анестезией, он также может быть применен к другим патологическим состояниям, таким как травма головного мозга у детей, эпилепсия и инсульт. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что использование модели поросят требует опыта и практики в реализации. Кроме того, использование микроэлектродных матриц требует специализированного набора навыков.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы хирургического вмешательства и установки микроэлектродов сложны в освоении из-за их деликатного характера. Для этого эксперимента используйте поросят во время пика роста мозга, когда им от трех до пяти дней. Дайте им акклиматизироваться не менее чем за 24 часа до эксперимента.

За поросятами должен ухаживать обученный персонал. Они должны быть обеспечены свободным доступом к питанию, одеялам и некоторым игрушкам для стимуляции. Не менее чем за три часа до анестезии извлеките заменитель молока из клетки, чтобы желудок поросенка был пустым.

Следуйте рекомендациям ARRIVE, чтобы устранить любые потенциальные факторы, связанные с сексом. В дальнейшем на анестезиологическом рабочем месте, оснащенном педиатрическим аппаратом искусственной вентиляции легких и соответствующими контрольными приборами, проводят интубацию и искусственную вентиляцию легких поросенка. Затем введите анестезию севофлураном в дозе 1 MAC в течение 3,5 часов анестезии.

Теперь ущипните палец ноги, чтобы подтвердить достаточную глубину анестезии, затем закрепите поросенка на специальной стереотаксической раме с достаточной набивкой. Расположите зубы верхней челюсти над зубчатым стержнем. Затем зафиксируйте и затяните две проникающие ушные планки с центром поросенка по средней линии.

Вставьте ушные планки достаточно плотно, чтобы слышать хлопок барабанных перепонок. Начните нагрузку рокурония и инфузию, чтобы предотвратить движения, пока поросенок закреплен в раме. Жизненно важно, чтобы поросенок оставался в тепле и чтобы его жизненные показатели контролировались.

Используйте тепловую лампу и/или одеяло для поддержания нормальной температуры. Следите за тем, чтобы тепловая лампа не находилась так близко, чтобы она не сгорела. Если поросят желательны для выживания, примите дополнительные препараты для поддержания стерильности операционного поля.

Теперь приступаем к имплантации микроэлектродной матрицы. Для начала сделайте разрез по средней линии длиной от четырех до шести сантиметров вдоль черепа, соблюдая осторожность, чтобы не поцарапать череп скальпелем. После того, как разрез будет сделан, используйте мягкое втягивание и тупое рассечение, чтобы приподнять кожу головы от черепа.

Затем аккуратно потрите череп марлевой салфеткой, чтобы удалить любую соединительную ткань и обнажить линии швов. Затем определите предполагаемое место проведения трепанации черепа. Если интересующая область остается затемненной, дополнительно отразите кожу головы.

Теперь с помощью хирургического сверла создайте окно для трепанации черепа площадью около 0,25 квадратного сантиметра над интересующей структурой. Будьте осторожны, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку или нижележащий мозг. При необходимости используйте тонкие хирургические инструменты для иссечения твердой мозговой оболочки, находящейся над мозговой тканью.

Будьте предельно осторожны, чтобы не повредить мозг. В этом эксперименте используется ранее описанная микроэлектродная решетка на основе ферментов, предварительно покрытая глутаматоксидазой и гальванизированная мФД. Микроэлектродные массивы имеют жесткий вал диаметром 40 мм, адаптированный для использования с поросятами.

Закрепите металлический кронштейн на микроманипуляторе, а затем расположите массив микроэлектродов как можно вертикальнее над брегмой. Затем осторожно опустите массив как можно ниже, не касаясь поверхности черепа, отмечая координаты брегмы. Теперь используйте атлас мозга поросенка, чтобы определить точные стереотаксические координаты интересующей структуры, а затем соответствующим образом переместите микроэлектрод.

Далее поместите псевдоэлектрод сравнения под кожу головы, обеспечив контакт с животным. Теперь медленно опустите микроэлектродную решетку в мозг почти на соответствующую глубину. Для последних двух миллиметров хода используйте гидравлический микропривод, чтобы аккуратно опустить массив в интересующую конструкцию с минимальной травматичностью тканей.

После того, как микроэлектродная решетка будет установлена, подождите 30 минут, чтобы электроды достигли исходного уровня. Затем проводите замеры в течение примерно трех часов. Если поросенок хочет выжить в эксперименте, закройте разрез после сбора данных.

Измерения глутамата in vivo в реальном времени проводились в гиппокампе трех-четырехдневных поросят под анестезией севофлураном, как описано выше. Сеансы записи превысили три часа. Измерения амперометрии регистрировались при частоте 4 Гц и преобразовывались в концентрацию с помощью линейной регрессии на основе калибровочных параметров.

Для каждой временной точки сигналы от двух глутамат-чувствительных участков были усреднены перед вычитанием усредненного сигнала сигнала, чтобы получить скорректированный сигнал глутамата. Средняя базальная концентрация глутамата составляла примерно 4,6 микромоль и оставалась относительно стабильной в течение всего срока воздействия анестетика. Переходная глутаматергическая активность была идентифицирована путем анализа пиков сигнала, которые не коррелировали с сигналом сигнала и имели отношение сигнал/шум более трех.

Всего за экспериментальный период было обнаружено 116 переходных пиков. Амплитуда результирующих переходных пиков в целом находилась в диапазоне 1 микромоль. Для количественной оценки продолжительности каждого переходного процесса было получено время, необходимое для затухания каждого максимального пикового значения на 80%, и оказалось, что оно составляет от 4 до 5,5 секунд.

После освоения эту технику можно сделать за четыре часа, если ее методично и аккуратно выполнять. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о минимизации любого непреднамеренного повреждения тканей, которое может исказить экспериментальные данные. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как измерение других электрохимических аналитов, чтобы ответить на дополнительные вопросы.