Изоляция и анализ микробных сообществ в почве, ризосфере и корни в экспериментах многолетние травы

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиома почвы, ризосферы и эндосферы корня, например, как разнообразие микробных сообществ изменяется в ответ на тип образца, обработку и генотип растения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он хорошо подходит для полевых экспериментов, требующих большого количества образцов и повторения. Демонстрировать процедуру буду я и Стефани Футрелл, аспирантка и научный сотрудник моей лаборатории.

Чтобы начать составление протокола, пометьте умывальник и ведро стикером с подробной информацией об образце растения. Отнесите маркированное ведро на участок и оставьте умывальник на установленном рабочем месте в поле. Случайным образом выбирайте и собирайте два растения на участке с разных участков участка.

Далее прокалывают почву лопатой на глубину до 30 сантиметров, чтобы обрезать любой из боковых корней, удерживающих растение в почве. Выкопайте корни растений, используя лопату, и поместите корневой ком в помеченное ведро. Принесите ведро обратно на рабочую станцию в поле.

Встряхните корни и с помощью лопаты или ручного культиватора удалите почву с корней. Наденьте перчатки и поместите корни рядом со станцией обработки. Встряхнув корни, перемешайте почву в умывальнике и разбейте все комья почвы с помощью ручного культиватора.

Поместите образец почвы, свободный от мусора, в промаркированный пакет для хранения на молнии размером 17,7 на 19,5 см и положите его на лед. Простерилизуйте секаторные ножницы в 70% этаноле. Используйте стерильные ножницы, чтобы вырезать различные корни, примерно от четырех до шести корней на растение и каждый корень около девяти-12 сантиметров в длину.

Поместите исчерпанные корни в промаркированную 50-миллилитровую пробирку, содержащую 35 миллилитров автоклавного фосфатного буфера с поверхностно-активным веществом, таким как Silwet L-77. Встряхните трубки в течение двух минут, чтобы освободить ризосферу от поверхности корней. Улучшите тряску с помощью генератора и вортексера.

С помощью щипцов, стерилизованных в 70% этаноле, удалите корни из трубки, кратковременно промокните их на бумажных полотенцах и поместите в новую промаркированную 50-миллилитровую трубку. Положите на лед и трубку, содержащую ризосферу, и трубку, содержащую корни. Добавьте примерно 35 миллилитров 50%-ного отбеливателя плюс 0,01%Tween 20 в 50-миллилитровые пробирки с корнями, собранными в поле.

Встряхните трубки в течение 30-60 секунд. Слейте отбеливатель, добавьте 35 миллилитров 70% этанола и сделайте вихрь или встряхните корни еще от 30 до 60 секунд. После встряхивания слейте 70%-ный этанол и добавьте 35 миллилитров стерильной, сверхчистой воды и вортекс или встряхните образец в течение одной минуты.

Повторите этап промывки водой еще два раза, чтобы корень получил в общей сложности три полоскания стерильной, сверхчистой водой. Промокните корни на сухих чистых бумажных полотенцах и используйте чистое бумажное полотенце для каждого образца. Используя стерильные щипцы и секаторы, разрежьте корни примерно на пятимиллиметровые кусочки и поместите срезанные корни в чистую 15-миллилитровую коническую трубку с маркировкой, затем храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшей обработки.

Встряхните 50-миллилитровые пробирки, содержащие образцы ризосферы, с поля в течение 20-30 секунд, чтобы снова суспендировать весь образец. С помощью стерильного сетчатого сетчатого фильтра толщиной 100 микрон отфильтруйте повторно суспендированный образец в новую 50-миллилитровую пробирку. Затем центрифугируйте пробирки при 3 000 раз g в течение пяти минут при комнатной температуре.

Сразу же слейте и выбросьте надосадочную жидкость. Поместите гранулы ризосферы в 50-миллилитровые пробирки на лед. Далее добавьте 1,5 миллилитра стерильного фосфатного буфера без поверхностно-активного вещества в гранулы ризосферы и сделайте их вихревыми для повторного суспендирования образца.

Пипеткой наденьте взвешенную жидкость в чистую промаркированную двухмиллилитровую микропробирку. Вращайте трубки при 15, 871 умножении на g в течение двух минут при комнатной температуре. Сразу же слейте надосадочную жидкость и слейте воду из трубок на чистые бумажные полотенца.

Храните гранулы при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшей обработки. С помощью стерильного металлического шпателя заполните чистую двухмиллилитровую пробирку примерно тремя граммами почвы для извлечения ДНК и избегайте мелких кусочков корней и мусора. Промойте металлический шпатель в 70% этаноле между каждым образцом.

Храните этот образец почвы при температуре минус 20 градусов по Цельсию. В чистой умывальнике высыпьте мешок с землей в сложенные друг на друга сита с большим ситом поверх меньшего сита и вручную просейте почву через оба сита. С помощью щетки тщательно очистите сита между образцами.

Отложите от 100 до 125 граммов просеянного грунта в мешок на молнии размером 17,7 на 19,5 см для будущего физико-химического и текстурного анализа почвы. Поместите мешки с почвой при температуре четыре градуса Цельсия для кратковременного хранения. Далее насыпьте жидкий азот в пластиковый стакан с чистыми шпателями и в чистую ступку.

Поместите застывшую ткань в ступку и растрите ее пестиком в мелкий порошок. Постоянно добавляйте жидкий азот во время измельчения, чтобы образцы оставались замороженными. С помощью шпателя перенесите измельченную ткань в чистую маркированную двухмиллилитровую пробирку, а затем храните ткань при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Протрите рабочую зону 70% этанолом и 1% бытовым отбеливателем. Достаньте образцы почвы из хранилища при температуре минус 20 градусов по Цельсию и разморозьте их в ведре со льдом. Снимите крышку уплотнительного коврика с 96-луночной экстракционной пластины и поместите крышку между двумя бумажными салфетками, чтобы сохранить ее в чистоте, пока она не используется.

Покройте 12 столбцов планшета клеевыми 8-луночными ПЦР-полосками во избежание загрязнения. Тару стерильную, небольшого размера увесить на весах небольшую воронку и отвесить от 200 до 250 миллиграмм грунта. Осторожно поднимите клейкую полоску вверх, поместите горловину заполненной воронки весов в соответствующую лунку и аккуратно направьте образец почвы в соответствующую лунку.

Замените клейкую ленту, чтобы закрыть лунку. Повторите этот процесс для каждой лунки, используя новую стерильную воронку для каждой пробы. Установите на место крышку уплотнительного коврика на планшете для экстракции и храните планшет при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока не будет готов к извлечению ДНК.

Извлеките образцы ризосферы из хранилища при температуре минус 20 градусов по Цельсию и разморозьте в ведре со льдом. Подготовьте пластину для извлечения ДНК, как описано в предыдущем разделе. Положите на весы чистую бумажную салфетку, затем проведите стерильным металлическим шпателем по весам.

С помощью шпателя осторожно вычерпните часть гранул ризосферы из пробирки с образцом. Весить от 200 до 250 миллиграммов образца ризосферы. Осторожно поднимите клейкую полоску, чтобы открыть первую лунку экстракционной пластины.

Наклоните заполненный шпатель в лунку и соскребите материал ризосферы в соответствующую лунку стерильной зубочисткой. Промойте металлический шпатель в воде, а затем добавьте 70% этанол между образцами. Наконец, повторяйте этот процесс для каждой лунки пластины до тех пор, пока пластина не будет заполнена, оставив одну лунку пустой в качестве контрольной заготовки для экстракции.

В этом репрезентативном наборе данных наблюдались весьма значимые различия между типами образцов, а ризосфера и почва, по-видимому, более похожи друг на друга по составу, чем корень. Дальнейший анализ показывает, что также наблюдались весьма значимые различия в составе микробного сообщества между ризосферой и почвой. Анализ альфа-разнообразия показывает, что микробные сообщества в эндосфере были ниже, чем в почве и ризосфере.

Единственное существенное различие в разнообразии между видами трав было между эндосферными образцами большого голубого стебля и проса. Анализ относительной численности подчеркивает доминирование протеобактерий, за которыми следуют актинобактерии во всех типах образцов. В почве и ризосфере преобладают ацидобактерии и хлорфлекси, в то время как корни имели большее относительное обилие бактериодетов.

Анализ всех типов образцов методом PERMANOVA выявил весьма значимую разницу в составе микробного сообщества, обусловленную видами растений. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять ряд шагов для изучения микробиомов почвы, эндосферы и ризосферы. Мы хотели бы поблагодарить Nebraska EPSCoR и Национальный научный фонд EPSCoR Research Infrastructure Program Track 1 за частичное финансирование этого образовательного видео.