Метод липидной экстракции и анализа для характеристики микробов почвы в экспериментах со многими образцами

Целью данного видео является описание метода, повышающего производительность при одновременном балансировании усилий и точности извлечения липидов из клеточных мембран микроорганизмов для использования в характеристике как общего количества липидов, так и относительного содержания индикаторных липидов для определения структуры почвенного микробного сообщества и исследований с большим количеством образцов. В полевых условиях вы должны учитывать неоднородность почвы, собирая образцы почвы таким образом, чтобы они представляли ваш участок. Чтобы сохранить микробное сообщество на момент отбора проб, образцы следует транспортировать с поля на льду.

Вернувшись в лабораторию, удалите корни и камни и разбейте комья путем грубого просеивания. Это также служит для гомогенизации образца. Подготовьтесь к сублимационной сушке, поместив подобразцы в соответствующие контейнеры, и как можно скорее высушите их в сублимационной сушке.

После того, как почва будет высушена, храните в герметичном контейнере с влагопоглотителем до извлечения. Лучше всего хранить высушенный грунт в морозильной камере при температуре 80 градусов C.As подготовке к экстракции, удалить сублимированный грунт из хранилища и измельчить. Методы измельчения включают шаровую мельницу, шаровой метр или ступку и пестик.

После измельчения почвы, опять же, тщательно гомогенизируйте образцы почвы и храните в морозильной камере. Вся лабораторная посуда должна быть скрупулезно чистой. Любые остатки моющего средства, смазки или грязи могут повлиять на результаты, проявляясь в виде пика на окончательной хроматограмме ГХ.

Экстракции проводятся в тефлоновых центрифужных пробирках объемом 30 миллилитров, которые необходимо промыть растворителем. Добавьте два-три миллилитра гексана в пробирки и заведите вихрь на несколько секунд. Сцедите гексан в другую трубку и сделайте вихрь.

Два-три миллилитра гексана можно использовать для последовательного промывания шести тюбиков. Храните промытые пробирки с гексаном вверх дном в вытяжном шкафу и утилизируйте использованный гексан в соответствующем контейнере для отходов. Стеклянную посуду можно заглушить или прополоскать растворителем непосредственно перед использованием.

Глушение обеспечивает чистоту стеклянной посуды за счет окисления остатков при высокой температуре. Заверните стеклянную посуду в два-три слоя алюминиевой фольги и поставьте в муфельную печь. Установите температуру 450 градусов С, и как только печь достигнет заданного значения, выпекайте не менее 4 1/2 часов.

Дайте не менее одного часа на остывание, прежде чем вынимать из печи. Маркируйте и взвешивайте промытые гексаном тефлоновые трубки. Добавьте грунт в тефлоновые центрифугированные трубки и повторно взвесьте для получения массы почвы.

Всегда вносите не менее двух заготовок на партию и включайте в комплект проверочный стандарт, желательно грунт, который был ранее извлечен, если вы хотите убедиться, что добыча прошла правильно. Экстракция липидов. Подготовьте три пипетки объемом от 5 до 10 миллилитров для фосфатного буфера, хлороформа и метанола.

Хлороформ представляет собой очень плотную жидкость с низким поверхностным натяжением. Следите за тем, чтобы выдаваемое вами количество было точным и постоянным. Держите бутылку как минимум наполовину заполненной жидкостью.

В вытяжной шкаф добавьте реагенты в почву в тефлоновой трубке в следующем порядке: фосфатный буфер, хлороформ и метанол. Это первая физическая экстракция липидов из материала образца. Рецептуры растворов реагентов вносятся в письменный протокол.

Пропорции растворителя и порядок добавления важны для правильного разделения органической и водной фаз. Дайте почве время намокнуть после добавления буфера перед добавлением хлороформа. Если это удобно, экстрагенты могут быть объединены и добавлены как единая аликвота для второй и любых последующих экстракций.

Плотно закройте тефлоновые трубки крышкой для защиты от света. Поместите их на шейкер горизонтально, убедившись, что они надежно закреплены. При высокой скорости встряхивайте в течение часа.

Пока пробирки встряхиваются, подготовьте две длинные стеклянные пробирки для каждого образца следующим образом. Разметьте тюбик, добавьте такой же объем хлороформа, который был добавлен в почву и такой же объем фосфатного буфера. После извлечения тефлоновых трубок из шейкера при температуре 25 градусов С центрифугируйте пробирки в течение 10 минут при 2 500 об/мин.

Затем в вытяжном шкафу при выключенном свете сцеживают надосадочную жидкость из тефлоновой трубки в одну из длинных трубок. В стеклянной трубке должно быть видно разделение фаз. Нижний слой содержит органический растворитель, в первую очередь хлороформ, и липиды.

Это извлечение повторяется. Налейте надосадочную жидкость во вторую подготовленную ранее пробирку. Теперь вы дважды физически извлекли липиды из почвы.

Для большинства почв этого достаточно. Надежно закройте все длинные трубки класса крышками с тефлоновой подкладкой и переверните 10 раз для перемешивания. Разделите фазы под действием силы тяжести на ночь.

Дайте образцам постоять спокойно в течение ночи, чтобы полностью разделить две фазы. Для этого образцы хранят в темном шкафу или накрытых алюминиевой фольгой при комнатной температуре. Можно позволить экстрактам разделиться в течение выходных.

День второй, выделение липидов. На второй день водный слой отсасывается и липиды концентрируются путем удаления растворителя в вакуумной системе испарения. Образцы также можно высушить, поместив их в водяную или песчаную ванну и подав слабую струю азота.

Жидкость в пробирках теперь должна быть хорошо отделена и в значительной степени прозрачной. Если нет, или если граница между двумя слоями особенно толстая, дайте разделению продолжаться еще один день. Установите вакуумный аспиратор в вытяжку.

Это колба с боковым рычагом, соединенная с вакуумным насосом с помощью трубки Leaf Tygon и пастбищной пипеткой. При работающем насосе с помощью пипетки откачайте водную фазу в колбу. Отсасывайте верхний слой и интерфейс.

Это будет примерно 2/3 пути вниз. Проделайте это с двумя-тремя комплектами стеклянных трубок. Верхний слой может содержать несколько частичек грунта.

По возможности удалите их. Соедините экстракт из второго и/или третьего набора пробирок с экстрактом из первых двух, тщательно декантировав. Постарайтесь исключить из заливки любой твердый материал и промойте стенки трубки вращательным движением.

Используйте чистую пипетку для каждого образца и повторите этот процесс для остальных образцов. После того, как экстракты хлороформа смешались и постояли несколько минут, осмотрите поверхность жидкости. Часто образуется тонкий слой остаточной воды.

Если это присутствует, сделайте аспирацию, прежде чем продолжить. Остаточная вода может разрушать двойные связи жирных кислот, но очень небольшое количество должно испаряться вместе с растворителями по мере сушки образцов. Высушите все образцы с помощью вакуумного выпарного аппарата.

Плотно закупорьте пробирки и храните в морозильной камере при температуре 80 градусов С. День третий, омыление и метилирование. Для начала включаем водяные бани. Проверьте уровень воды и установите ванну 1 на 95 градусов С и ванну 2 на 80 градусов С. С помощью повторной пипетки добавьте один миллилитр реагента для омыления Реагент 1 к высушенным липидам.

Плотно закупорьте крышкой, кратковременно похлопайте и поставьте на решетку. Выполнив этот шаг, поместите решетку с пробирками в водяную баню при температуре 95 градусов С и подождите пять минут. Выньте решетку с трубками из ванны и проверьте трубки на герметичность.

На это будут указывать пузырьки, поднимающиеся в трубке как пена. Затяните или замените крышки протекающих трубок. Продолжайте нагревать трубки на водяной бане еще 10 минут.

Уменьшите температуру, установленную на водяной бане, до 80 градусов С и продолжайте инкубацию еще 15 минут. Извлеките трубки и охладите, поместив решетку в кастрюлю с водой из-под крана. Не используйте ледяную воду.

После того, как образцы остынут, добавьте в каждый образец два миллилитра реагента для метилирования, реагента 2. Снова плотно закройте крышку и подождите на пять-10 секунд. Гранулированные соли могут стать видимыми в виде осадка в растворе, что иногда происходит из-за избытка реагентов.

Поместите решетку на водяную баню при температуре 80 градусов Цельсия и выдерживайте в течение 10 минут. Снимите решетку с трубками с водяной баней и поставьте ее в кастрюлю с водой из-под крана для охлаждения. Взбалтывайте решетку, чтобы ускорить процесс охлаждения.

С помощью повторной пипетки добавьте по одному 1,25 миллилитров гексана и метилтретичного бутилового эфира, Реагент 3, в каждую пробирку для извлечения фазы. Плотно закупорьте крышки и поставьте трубки на шейкер на 10 минут. После встряхивания дайте штативу с пробирками постоять 10 минут, чтобы фазы разделились.

Перенесите органическую фазу, которая теперь является верхним слоем, в короткую стеклянную трубку с помощью пастбищной пипетки. Лучше всего восстановить большую часть жидкости. Очень малые количества водной фазы не повлияют на экстракцию.

Повторите экстракцию в водной фазе, добавив реагент 3, встряхнув, позволив фазам разделиться и перенеся верхнюю фазу. В зависимости от состояния нижней фазы, вы можете повторить это еще один раз, чтобы в общей сложности сделать три переноса. Добавьте 3 миллилитра базового средства для промывки, реагент 4, представляющий собой разбавленный раствор гидроксида натрия, к экстрактам в коротких пробирках.

Плотно закройте пробирки и держите в воздухе от 20 до 30 секунд, а затем центрифугируйте в течение трех минут при 2 000 оборотах в минуту. После центрифугирования с помощью чистой пастбищной пипетки отсадите верхнюю органическую фазу и переложите в янтарный флакон объемом четыре миллилитра. Будьте очень осторожны, чтобы не отсасывать какую-либо водную фазу.

Следующим этапом является выпаривание растворителя до полного высыхания в вакуумном выпарном аппарате. День четвертый, подготовка экстрактов для анализа GC. С помощью пипетки добавьте по 100 микролитров Реагента 3 в каждый из 4 миллилитровых флаконов, содержащих сухую фазу.

Сделайте образец вихрем, а затем дайте ему постоять 10 минут. С помощью второго дозеттера осторожно переложите взвешенные FAME во флакон с GC. Добавьте еще одну аликвоту растворителя в четырехмиллилитровый флакон и быстро

Прокатите флакон, чтобы убедиться, что остатки FAMA на стенках флакона растворились. С помощью второго дозатора снова переложите растворитель во флакон с ГХ. Завершите перенос, добавив третью аликвоту растворителя во флакон, фортексируя и переложив во флакон с GC

Закройте флакон GC крышкой и храните в морозильной камере. Храните запечатанные флаконы GC в морозильной камере перед анализом. GC-анализ.

Чтобы использовать эту систему, анализ должен быть выполнен с использованием определенного столбца GC. Газовый хроматограф оснащен разъемным неразъемным входным отверстием, оснащенным впускным вкладышем из четырехмиллиметрового внутреннего стекла с деактивированной пробкой из стекловаты. Входное отверстие установлено на 250 градусов С и работает в режиме постоянного давления.

Газом-носителем является водород. Азот и воздух необходимы в качестве вспомогательных газов для детектора. Используется колонка Agilent Ultra 2.

Колонна имеет длину 25 метров с внутренним диаметром 2 миллиметра и толщиной пленки неподвижной фазы 33 микрометра. Неподвижная фаза в этой колонке представляет собой 5% фенил, 95% метилполисилоксана, также известную как колонка типа DB-5. Для анализа липидных экстрактов аликвота в два микролитра вводится в соотношении 100:1 при температуре печи 170 градусов C.Post впрыскивании, печь программируется на повышение температуры со скоростью пять градусов в минуту до 300 градусов Цельсия, а затем выдерживается в течение 12 минут.

Производится серия инъекций стандарта MIDI, и результаты используются для внесения корректировок в соответствии с инструкциями в руководстве MIDI. После такой калибровки система иногда может нуждаться в незначительных корректировках, но в целом должна достигать хороших результатов при использовании этих параметров. MIDI-система создает отчет по каждому сэмплу, содержащий таблицу с одной строкой для каждого реализованного пика.

Программное обеспечение сообщает время удержания пика, площадь пика, идентификацию пика, а также ECL или расчетную длину цепи, параметр, используемый для идентификации пика, и коэффициент отклика, параметр, используемый для нормализации вариаций и отклика детектора в отношении времени удержания. ECL выражает то, где среди серии FAME с прямой цепью элюирует каждый неизвестный FAME. Так, например, если время удержания неизвестной цепи находится на полпути между временем удержания 12 и 13 углеродной цепи, ECL сообщается как 12,5 углеродной цепи.

Программное обеспечение сравнивает ECL каждого пика с ECL FAME в базе данных, а там, где происходят совпадения, присваивает соответствующее имя неизвестному. В случаях, когда два FAME в базе данных имеют очень близкие ECL, программное обеспечение сообщает обоим именам, указывая ближайшие имена первыми. Таблицы данных из отчетов могут быть собраны в электронную таблицу или базу данных.

После корректировки на коэффициент отклика пиковые площади могут быть затем сравнены с пиковой площадью внешнего или внутреннего стандарта, чтобы получить концентрацию экстракта. Путем деления по массе извлеченной почвы данные могут быть выражены в виде массы FAME на грамм почвы или, также используя молекулярную массу каждого FAME, в виде наномолей на грамм почвы. Затем биомаркеры FAME могут быть суммированы для получения биомассы микробных гильдий, и эти гильдии могут быть дополнительно проанализированы.

Например, здесь мы видим неудобренные прерии с большей биомассой FAME, чем удобренные прерии. Оба имеют больше биомассы, чем близлежащие кукурузные поля. Кроме того, FAME связаны с определенными функциональными группами, такими как грибы или бактерии.

Эти ассоциации специфичны для экосистемы, поэтому важно не обобщать их. Этот тип анализа показывает, являются ли определенные группы более многочисленными в определенных условиях. Здесь грибы в изобилии встречаются в неудобренных прериях, чем на кукурузных полях.

И, наконец, еще один способ взглянуть на общий состав микробного сообщества — это сравнение, глядя на относительное распространенность всех FAME одновременно, используя методы ординации, такие как неметрическое многомерное масштабирование, NMDS или анализ главных компонент, PCA. При ординации микробные сообщества, которые более похожи, будут ближе друг к другу. Таким образом, из данных нашего примера следует, что кукуруза и неудобренные прерии находятся очень далеко друг от друга, в то время как некоторые удобренные образцы прерий имеют микробные сообщества, которые напоминают сообщества кукурузы, а другие напоминают неоплодотворенные прерии.

Микробные сообщества часто очень изменчивы даже в пределах окружающей среды, поэтому они не всегда будут четко разделяться. После просмотра этого видео следует хорошо понимать, с помощью какого процесса из почвы извлекаются липидные биомаркеры из клеточных мембран микроорганизмов. Экстракция фосфолипидных жирных кислот является эффективным, быстрым и недорогим способом оценки микробных гильдий и общей микробной биомассы путем идентификации уникальных микробных биомаркеров.