Метод липидной экстракции и анализа для характеристики микробов почвы в экспериментах со многими образцами

Целью данного видео является описание метода, который повышает пропускную способность при соблюдении баланса между трудозатратами и точностью экстракции липидов из клеточных мембран микроорганизмов. Этот метод предназначен для характеристики как общего состава липидов, так и относительного содержания индикаторных липидов с целью определения структуры почвенного микробного сообщества в исследованиях с большим количеством образцов. При работе в поле необходимо учитывать неоднородность почвы, отбирая пробы таким образом, чтобы они были репрезентативны для вашего участка. Чтобы сохранить состав микробного сообщества на момент отбора, образцы следует транспортировать из поля на льду.

По возвращении в лабораторию удалите корни и камни, а комки почвы разбейте с помощью грубого просеивания. Это также поможет гомогенизировать образец. Подготовьтесь к лиофилизации, поместив части проб в подходящие контейнеры, и проведите лиофилизацию как можно скорее.

После лиофилизации почв храните их в герметичном контейнере с десикантом до начала экстракции. Рекомендуется хранить лиофилизированные почвы при температуре -80 °C. В качестве подготовки к экстракции извлеките лиофилизированные почвы из хранилища и измельчите. Для измельчения можно использовать шаровую мельницу, шарового измельчителя или ступку с пестиком.

После измельчения почвы снова тщательно гомогенизируйте образцы почвы и поместите их в морозильную камеру. Вся лабораторная посуда должна быть безупречно чистой. Любые остатки моющих средств, жира или грязи могут повлиять на результаты, проявившись в виде пика на итоговой хроматограмме ГХ.

Экстракции проводят в тефлоновых центрифужных пробирках объемом 30 мл, которые необходимо промыть растворителем. Добавьте в пробирки от двух до трех миллилитров гексана и перемешайте на вортексе в течение нескольких секунд. Слейте гексан в другую пробирку и снова перемешайте на вортексе.

Две-три миллилитра гексана можно использовать для последовательного промывания шести пробирок. Храните промытые гексаном пробирки в перевернутом виде в вытяжном шкафу, а использованный гексан утилизируйте в соответствующий контейнер для отходов. Стеклянную посуду можно прокалить в муфельной печи или промыть растворителем непосредственно перед использованием.

Прокаливание обеспечивает чистоту стеклянной посуды путем окисления остатков при высокой температуре. Оберните стеклянную посуду двумя или тремя слоями алюминиевой фольги и поместите в муфельную печь. Установите температуру 450 °C, и после достижения печью заданного значения прокаливайте в течение как минимум 4 1/2 часов.

Оставьте охлаждаться минимум на один час перед извлечением из печи. Маркируйте и взвесьте тефлоновые пробирки, промытые гексаном. Поместите почву в тефлоновые центрифужные пробирки и снова взвесьте для определения массы почвы.

Всегда готовьте как минимум два холостых опыта на партию и включайте контрольный стандарт, предпочтительно почву, из которой ранее проводилась экстракция, если вы хотите убедиться в правильности хода экстракции. Экстракция липидов. Подготовьте три репипетки объемом от 5 до 10 мл для фосфатного буфера, хлороформа и метанола.

Хлороформ представляет собой очень плотную жидкость с низким поверхностным натяжением. Следите за тем, чтобы дозируемый объем был точным и постоянным. Держите флакон заполненным жидкостью как минимум наполовину.

В вытяжном шкафу добавьте в почву в тефлоновой пробирке следующие реагенты в указанном порядке: фосфатный буфер, хлороформ и метанол. Это первая стадия физической экстракции липидов из вашего образца. Рецепты растворов реагентов приведены в письменном протоколе.

Пропорции растворителей и порядок их добавления имеют важное значение для правильного разделения органической и водной фаз. После добавления буфера дайте почвам время на увлажнение, прежде чем добавлять хлороформ. При необходимости экстрагенты можно смешать и добавить одной аликвотой при втором и всех последующих этапах экстракции.

Плотно закройте тефлоновые пробирки крышками и оберните их для защиты от света. Поместите их на шейкер горизонтально, убедившись, что они надежно закреплены. При установке высокой скорости перемешивания встряхивайте в течение одного часа.

Пока пробирки перемешиваются, подготовьте две длинные стеклянные пробирки для каждого образца следующим образом. Маркируйте пробирку, добавьте объем хлороформа, равный объему, добавленному в почву, и такой же объем фосфатного буфера. Извлеките тефлоновые пробирки из шейкера при 25 °C и центрифугируйте их в течение 10 минут при 2 500 об/мин.

Затем в вытяжном шкафу при выключенном свете перелейте супернадант из тефлоновой пробирки в одну из длинных пробирок. В стеклянной пробирке должно быть видно разделение фаз. Нижний слой содержит органический растворитель, преимущественно хлороформ, и липиды.

Данную экстракцию повторяют. Перелейте супернатант во вторую пробирку, подготовленную ранее. Таким образом, вы провели физическую экстракцию липидов из почвы дважды.

Для большинства типов почв этого достаточно. Плотно закройте все пробирки с длинным классом крышками с тефлоновым покрытием и переверните 10 раз для перемешивания. Оставьте пробирки в покое на ночь для разделения фаз под действием силы тяжести.

Оставьте образцы в покое на ночь до полного разделения двух фаз. Для этого храните образцы в темном шкафу или накрытыми алюминиевой фольгой при комнатной температуре. Допускается разделение экстрактов в течение выходных.

День второй, выделение липидов. На второй день аспирируют водный слой, а липиды концентрируют путем удаления растворителя в системе вакуумного испарения. Образцы также можно высушить, поместив их в водяную или песчаную баню и обдувая слабым потоком азота.

Жидкость в пробирках теперь должна быть хорошо разделена и в значительной степени прозрачна. Если этого не произошло или если граница раздела между двумя слоями особенно толстая, дайте разделению продолжиться еще один день. Установите вакуумный аспиратор в вытяжном шкафу.

Это колба с боковым отводом, подключенная к вакуумному насосу с помощью трубки Tygon и пастернационной пипетки. При работающем насосе используйте пипетку, чтобы перенести водную фазу в колбу. Отсосите верхний слой и фазовую границу.

Это будет примерно на 2/3 глубины. Повторите процедуру для двух-трех наборов стеклянных трубок. Верхний слой может содержать несколько частиц почвы.

Удалите их, если это возможно. Объедините экстракт из второго и/или третьего набора пробирок с экстрактом из первых двух, осторожно сливая жидкость. Старайтесь не допускать попадания твердого материала при сливе и промойте стенки пробирки, вращая ее.

Используйте чистую пипетку для каждого образца и повторите этот процесс для остальных образцов. После объединения хлороформных экстрактов и выдержки в течение нескольких минут осмотрите поверхность жидкости. Часто образуется тонкий слой остаточной воды.

При наличии остатка жидкости удалите его с помощью аспиратора перед тем, как продолжить. Остаточная вода может воздействовать на двойные связи жирных кислот, однако крайне малое ее количество должно испариться вместе с растворителями в процессе высушивания образцов. Высушите все образцы, используя аппарат для вакуумного испарения.

Плотно закройте пробирки крышками и храните в морозильной камере при -80 °C. День третий: омыление и метилирование. Сначала включите водяные бани. Проверьте уровень воды и установите температуру в первой бане на 95 °C, а во второй — на 80 °C. С помощью репипеточного дозатора добавьте 1 mL реагента для омыления (Реагент 1) к высушенным липидам.

Плотно закройте крышки, коротко перемешайте на вортексе и установите пробирки в штатив. После завершения этого этапа поместите штатив с пробирками в водяную баню при температуре 95 °C на пять минут. Извлеките штатив из бани и проверьте пробирки на наличие утечек.

Это будет сопровождаться появлением пузырьков, поднимающихся в пробирке подобно пене. Плотнее закрутите или замените крышки протекающих пробирок. Продолжайте нагревать пробирки на водяной бане еще в течение 10 минут.

Снизьте температуру водяной бани до 80 °C и продолжайте инкубацию еще в течение 15 минут. Извлеките пробирки и охладите их, поместив штатив в емкость с водопроводной водой. Не используйте ледяную воду.

После охлаждения образцов добавьте в каждый из них по два миллилитра метилирующего реагента (Реагент 2). Снова плотно закройте пробирки крышками и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд. В растворе может появиться осадок в виде гранулярных солей, что иногда случается из-за избытка реагентов.

Поместите штатив в водяную баню с температурой 80 °C и инкубируйте в течение 10 минут. Извлеките штатив с пробирками из водяной бани и поместите его в кювету с водопроводной водой для охлаждения. Встряхивайте штатив, чтобы ускорить процесс охлаждения.

С помощью репипеточного дозатора добавьте по 1,25 миллилитров гексана и метил-трет-бутилового эфира (реагент 3) в каждую пробирку для экстракции фазы. Плотно закройте крышки и поместите пробирки на шейкер на 10 минут. После перемешивания оставьте штатив с пробирками в покое на 10 минут для разделения фаз.

Перенесите органическую фазу, которая теперь находится в верхнем слое, в короткую стеклянную пробирку с помощью пастеровской пипетки. Желательно собрать максимальный объем жидкости. Попадание очень малого количества водной фазы не повлияет на качество экстракции.

Повторите экстракцию водной фазы: добавьте реагент 3, перемешайте, дождитесь разделения фаз и перенесите верхнюю фазу. В зависимости от состояния нижней фазы эту процедуру можно повторить еще один раз, чтобы в общей сложности выполнить три переноса. Добавьте 3 milliliter щелочного промывочного раствора (реагент 4), представляющего собой разбавленный раствор гидроксида натрия, к экстрактам в коротких пробирках.

Плотно закройте пробирки крышками, перемешайте на вортексе в течение 20–30 секунд, а затем центрифугируйте в течение трех минут при 2 000 RPM. После центрифугирования с помощью чистой пастернажной пипетки отберите верхнюю органическую фазу и перенесите ее в четырехмиллилитровый флакон из темного стекла. Будьте очень осторожны, чтобы не аспирировать водную фазу.

Следующий шаг — выпаривание растворителя досуха в вакуумном испарителе. День четвертый, подготовка экстрактов для анализа методом ГХ. С помощью дозатора добавьте 100 µL Реагента 3 в каждый флакон объемом 4 мл, содержащий высушенную фазу.

Перемешайте образец на вортексе, затем оставьте его на 10 минут. С помощью второго дозатора осторожно перенесите взвесь FAMEs в виалу для ГХ. Добавьте еще одну аликвоту растворителя в четырехмиллилитровую виалу и коротко перемешайте на вортексе.

Перекатите флакон, чтобы остатки FAMEs на его стенках растворились. С помощью второго дозатора снова перенесите растворитель в пробирку для ГХ. Завершите перенос, добавив в флакон третью аликвоту растворителя, перемешав содержимое на вортексе и перенеся его в пробирку для ГХ.

Закройте флакон для ГХ крышкой и поместите в морозильную камеру. Храните герметично закрытые флаконы для ГХ в морозильной камере до проведения анализа. ГХ-анализ.

Для использования данной системы анализ необходимо проводить с применением специальной колонки для ГХ. Газовый хроматограф оснащен инжектором с режимами разделения и без разделения (split/splitless), укомплектованным стеклянным лайнером с внутренним диаметром 4 мм и деактивированной ватной заглушкой. Температура инжектора установлена на 250 °C, работа осуществляется в режиме постоянного давления.

В качестве газа-носителя используется водород. Азот и воздух необходимы в качестве вспомогательных газов для детектора. Используется колонка Agilent Ultra 2.

Длина колонки составляет 25 метров, внутренний диаметр — 2 мм, толщина слоя неподвижной фазы — 33 мкм. Неподвижной фазой в данной колонке является 5% фенил, 95% метилполисилоксан, также известная как колонка типа DB-5. Для анализа липидных экстрактов аликвота объемом 2 мкл вводится при соотношении сплита 100:1 и температуре термостата 170 °C. После ввода настроен подъем температуры термостата со скоростью 5 °C в минуту до 300 °C с последующим удержанием в течение 12 минут.

Выполняется серия инъекций по стандарту MIDI, и результаты используются для внесения корректировок в соответствии с инструкциями в руководстве к MIDI. После такой калибровки системе могут потребоваться периодические незначительные настройки, но в целом она должна обеспечивать хорошие результаты при использовании данных параметров. Система MIDI формирует отчет для каждого образца, содержащий таблицу, в которой каждой зарегистрированной вершине соответствует одна строка.

Программное обеспечение сообщает время удерживания пика, площадь пика, идентификацию пика, а также ECL или расчетную длину цепи — параметр, используемый для идентификации пика, и коэффициент отклика — параметр, используемый для нормализации вариаций и отклика детектора относительно времени удерживания. ECL показывает, где в серии линейных FAME элюирует каждый неизвестный FAME. Например, если время удерживания неизвестного вещества приходится на середину между веществами с длиной цепи 12 и 13 атомов углерода, ECL указывается как 12,5 атомов углерода.

Программное обеспечение сравнивает ECL каждого пика с данными FAME из базы данных и, при совпадении, присваивает неизвестному веществу соответствующее наименование. В случаях, когда два FAME в базе данных имеют очень близкие значения ECL, программа указывает оба названия, перечисляя наиболее близкое первым. Таблицы данных из отчетов могут быть объединены в электронную таблицу или базу данных.

После поправки на коэффициент отклика площади пиков можно сравнить с площадью пика внешнего или внутреннего стандарта для определения концентрации экстракта. Путем деления на массу экстрагированной почвы данные могут быть выражены как масса FAME на грамм почвы или, с учетом молекулярной массы каждого FAME, как наномоли на грамм почвы. Затем можно суммировать FAME биомаркеров для определения биомассы микробных групп, которые затем могут быть подвергнуты дальнейшему анализу.

Например, здесь мы видим, что на неоплодотворенных прериях биомасса FAME выше, чем на оплодотворенных прериях. В обоих случаях биомасса выше, чем на близлежащих кукурузных полях. Кроме того, FAME ассоциированы с определенными функциональными группами, такими как грибы или бактерии.

Эти взаимосвязи специфичны для конкретной экосистемы, поэтому важно избегать излишнего обобщения. Данный тип анализа позволяет определить, являются ли определенные группы более многочисленными в конкретных средах. В данном случае грибы более многочисленны в неудобряемой прерии, чем в кукурузном поле.

И наконец, еще один способ анализа общего состава микробного сообщества — это сравнение относительного содержания всех FAME одновременно с помощью методов ординации, таких как неметрическое многомерное масштабирование (NMDS) или анализ главных компонентов (PCA). При ординации более схожие микробные сообщества располагаются ближе друг к другу. Таким образом, согласно нашим примерным данным, образцы кукурузы и неудобряемой прерии находятся очень далеко друг от друга, в то время как некоторые образцы удобряемой прерии имеют микробные сообщества, напоминающие сообщества кукурузы, а другие — неудобряемой прерии.

Микробные сообщества часто характеризуются высокой вариабельностью даже внутри одной среды, поэтому они не всегда будут четко разделяться. После просмотра этого видео зритель должен получить хорошее представление о процессе экстракции липидных биомаркеров из клеточных мембран микроорганизмов из почвы. Экстракция фосфолипидных жирных кислот является эффективным, быстрым и недорогим способом оценки микробных гильдий и общей микробной биомассы путем идентификации уникальных микробных биомаркеров.