Горизонтальная целая гора: новый протокол обработки и обработки изображений для толстых, трехмерных поперечных сечений кожи

Общая цель этого гистологического и визуализирующего протокола состоит в том, чтобы представить надежную систему, которая сохраняет эпитолическую антигенность и структурную целостность кожи, что позволяет в полной мере использовать методы конфокальной визуализации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, требующие изучения природы любого типа клеток в сложной трехмерной архитектуре ткани. Основное преимущество этой методики по сравнению со стандартными гистологическими методиками заключается в том, что она надежна и проста в выполнении.

Кроме того, протокол прекрасно дополняет трехмерный анализ в конфокальной микроскопии. Начните с обрезки кожи, собранной с дорсальной медиальной области мыши, на прямоугольные кусочки. Каждая деталь должна иметь размер, чтобы поместиться на дне криоформы.

Здесь демонстрируется площадь спинной кожи площадью в один квадратный сантиметр, которая укладывается в криомолд размером 22 на 30 на 20 миллиметров. После фиксации прижмите промытую кожу ко дну заполненной OCT формы так, чтобы она лежала заподлицо с дном. Отметьте ориентацию волосяного фолликула на криоформе, так как от этого зависит ориентация криостатического среза.

Перенесите криоблоки на металлическую пластину в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов, чтобы предотвратить всплытие и вывих ткани. Следите за процессом замораживания, чтобы сохранить ориентацию кожи на дне криоформы, так как невидимые пузырьки воздуха могут привести к тому, что кожа поднимется к поверхности криоформы. Начните с фиксации замороженного криоблока на стадии криостата с ориентацией волосяного фолликула, как указано на криомолде вдоль плоскости разрезания.

Правильная настройка точной ориентации волосяного фолликула на криостате имеет решающее значение, так как на этом этапе определяется плоскость сечения, в которой образуются срезы кожи с неповрежденными волосяными фолликулами по всей длине. С помощью криостата разрежьте срез размером 100 микрон. Захватите ОКТ вокруг внедренного кусочка кожи с помощью щипцов и перенесите участок из криостата в 100-миллиметровую культуру, наполненную PBS.

При комнатной температуре PBS растворит ОКТ, оставив срезы кожи, с которыми легко работать щипцами. После разрезания с помощью щипцов перенесите плавающие участки кожи в лунку 12-луночного планшета, содержащего 2,5 миллилитров PBS. Начните иммунофлуоресцентное мечение с добавления 500 микролитров PB-буфера в меченые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Осторожно с помощью щипцов перенесите срезы кожи из 12-луночной пластины в пробирки для блокировки. Убедитесь, что все срезы кожи полностью погружены в воду. Поместите микроцентрифужные пробирки на коромысло пилы со скоростью 10 колебаний в минуту или менее в течение одного часа при комнатной температуре.

Промаркируйте отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитра для каждого среза кожи и добавьте 500 микролитров PB-буфера, содержащего соответствующее количество первичного антитела. После одного часа блокировки переложите срезы кожи в свежеподготовленные пробирки, содержащие антитела. Инкубируйте ломтики при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи на низкой скорости на коромысле.

На следующий день переложите срезы в 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки, содержащие 500 микролитров PBS, и промойте в течение часа при комнатной температуре на качалке. Затем переложите срезы в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров, содержащие 500 микролитров PB-буфера с соответствующей концентрацией вторичных антител и DAPI. Инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа с укачиванием, при желании образцы могут храниться до четырех дней при четырех градусах Цельсия до дальнейшей обработки.

Перед визуализацией перенесите срезы кожи в отдельные микроцентрифужные пробирки, содержащие 500 микролитров PBS, для промывания вторичных антител и DAPI. Затем поместите крышку размером 22 на 50 миллилитров на темный фон под препарирующий микроскоп. Затем используйте пипетку объемом 1 000 микролитров с отрезанным концом наконечника, чтобы добавить одну каплю 100% глицерина на покровное стекло.

Перенесите срез кожицы из микроцентрифужной пробирки на каплю глицерина. Затем, глядя в препарирующий микроскоп, с помощью заостренных щипцов осторожно размотайте скрученные скручивающиеся участки кожи, возвращая им естественную форму, плавая в глицерине. Не стоит форсировать неестественное выпрямление среза, так как это может привести к повреждению тканей.

Как только вся длина секции будет правильно ориентирована и расплющена на покровном листе. Закрепите ткань на обычном предметном стекле микроскопа, этот шаг еще больше расправит срез кожи. Визуализируйте участки кожи, закрепленные глицерином, в течение следующих двух дней.

На этом изображении показан классически полученный криосекция кожи толщиной 10 микрон, помеченная интегрином альфа шесть и интегрином альфа восемь, для визуализации эпидермального компартмента и директорных мышц пили соответственно. Это 3D-сечение ткани толщиной 100 микрон было помечено таким же образом. На показанном рисунке показаны максимальные проекции большого стека z.

Детали обоих изображений сравниваются параллельно, в классических замороженных срезах большинство волосяных фолликулов, визуализированных с помощью интегрина альфа 6, не были разрезаны по всей длине, создавая преимущественно неполные волосяные фолликулы на секцию, по сравнению с горизонтальными целыми срезами. Интактные волосяные фолликулы и неповрежденные мышцы пили были количественно оценены как в классическом, так и в горизонтальном домашнем срезах. Один участок для биологической репликации был количественно определен, как видно на рисунке, весь участок горы имеет более высокую долю интактных фолликулов и мышц арректора пили.

После освоения эта техника криосекции может выполняться со скоростью более 15 секций в минуту, при этом при правильном монтаже образцы могут быть идеально ориентированы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как обрабатывать и анализировать толстые срезы тканей в трехмерной среде.