Крио-распыления Протокол для обработки мышь лапы для оценки молекулярных путей воспаления тканей в коллагениндовой модели артрита

Оценка молекулярных профилей в местных тканях является критическим шагом к пониманию механизма действия активных фармацевтических препаратов, поскольку они оцениваются в соответствующих заболеваниям доклинтических моделях. В области исследований артрита, местная среда ткани интерес малых несущих суставов, которые состоят из сложной смеси костей, хрящей, мышц и иммунных клеток. Здесь мы описываем надежный надежный метод механического нарушения и/или распыления этой сложной среды тканей в криогенно контролируемой среде.

Этот метод может быть использован для генерации ниже по течению протеомных и транскрипционных усилий профилирования для создания молекулярных подписей болезни из единого источника образца. Этот метод генерирует однородный порошок в отличие от многих других старых методов. Кроме того, старая процедура изоляции температуры позволяет изоляции высококачественной РНК.

Этот метод может быть использован для генерации ниже по течению протеомного и транскрипционные профилирования позволяет молекулярной характеристики соответствующих путей заболевания интерес. Этот метод может дать представление о любой области исследований, которая является производным молекулярных подписей из тканей. Метод может быть распространен на любую сложную систему тканей, которая имеет плотные и трудно отмежеваться от компонентов.

Хотя мы не оценивали до этого момента, мы могли видеть потенциальное применение к плотным хрящевым тканям, таким как уши или кости. Критический характер переноса порошка в трубки для взвешивания является то, что требует практики. Если слишком много времени будет отнято, порошок начнет оттаивать и становиться аморфным.

Важно ограничить количество образцов от 10 до 15, пока вы не будете комфортно с процедурой. В день обработки тканей, prechill все необходимые инструменты на сухом льду в течение как минимум 10 минут. Носите тепловые перчатки, чтобы избежать вреда от сильного холода.

Затем перенесите каждую подготовленную лапу мыши в отдельную микроцентрифугную трубку на 1,5 миллилитров и немедленно захватьте замораживание жидкого азота. Храните замороженные лапы при отрицательных 80 градусах по Цельсию. Когда вы будете готовы к продолжению, заполните морозильную мельницу жидким азотом и дайте ей равноденствия, по крайней мере 10 минут.

Поместите необработанный образец на сухой лед и держите его там, чтобы избежать циклов замораживания/оттепели. Затем перенесите одну заднюю лапу в предварительно охлажденный большой поликарбонатный шлифовальный флакон с нижней стальной вилкой. Вставьте предварительно охлажденный стальной ударник и закройте поликарбонатным шлифовальным флаконом с предварительно охлажденной верхней стальной вилкой.

Перенесите большие поликарбонатные шлифовальные флаконы с образцами в предварительно заполненную морозильную фабрику и закройте крышку резиновой застежкой, найденной в передней части инструмента. Дайте образцам остыть в жидком азоте в течение одной минуты. Затем установите морозильную мельницу на одну минуту программы с 10 циклов в секунду.

Нажмите кнопку запуска и ждать морозильной мельницы, чтобы завершить свой цикл. После этого откройте крышку морозильной камеры и вывихуте большой поликарбонатный шлифовальный флакон. Поместите шлифовальный флакон в экстрактор и удалите верхнюю стальную вилку, поставив понижательное давление на черную ручку до тех пор, пока стальная вилка не выскальзывает из поликарбонатной трубки.

Перенесите открытый шлифовальный флакон на сухой лед и используйте предварительно охлажденные типсы для удаления стального ударного. Перенесите замороженный порошок в предварительно охлажденную 50 миллилитровую коническую трубку. Взвешивание от 30 до 50 миллиграммов замороженного порошка в многоуровневую 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку для экстракции РНК и от 100 до 200 миллиграммов для извлечения белка.

Храните распыленные образцы при отрицательных 80 градусах по Цельсию и приступайте к изоляции РНК и белка в течение 24 часов. Во-первых, добавьте 10 микролитров бета-меркаптоэтанола на каждый миллилитр буфера RLT. Рассчитайте объем буфера RLT, соответствующий соотношению 23,3 миллилитров на миллиграмм ткани, и добавьте соответствующий объем буфера RLT с бета-меркаптоэтаноном в трубку с замороженным порошком.

Вихрь образца при 3000 об/мин в течение 10 секунд. Используйте один миллилитр пипетки для пипетки вверх и вниз энергично 10 раз и вихрем образца снова на 3000 об /мин в течение 20 секунд. Центрифуга при 13 000 г в течение двух минут и передача 700 микролитров супернатанта в свежую трубку.

Добавьте 700 микролитров 70% этанола в эту трубку и загрузите 700 микролитров образца на колонку очистки РНК. Центрифуга трубки со скоростью не менее 10 000 раз г в течение 30 секунд. Отбросьте протечку и загрузите оставшуюся часть образца на колонку RNeasy и снова центрифугу трубки со скоростью не менее 10 000 раз г в течение 30 секунд.

Отбросьте протеку и помойте столбец, добавив 700 микролитров буфера RW1 и центрифугировать по крайней мере скорость 10 000 раз г в течение 30 секунд. При выполнении опции пищеварения DNAse, 350 микролитров RW1 добавляется до лечения DNAse. И после лечения DNAse, дополнительные 350 микролитров RW1 добавляется.

Затем мыть столбец дважды, добавив 500 микролитров буфера RPE и центрифуги со скоростью не менее 10 000 раз г в течение 30 секунд убедившись, что отказаться от потока через каждый раз. После этого высушите столбец, центрифугировать его со скоростью не менее 10 000 раз г в течение двух минут. Утолите РНК, добавив 50 микролитров воды и центрифугирования со скоростью не менее 10 000 раз г в течение двух минут.

Соберите протечку и перенесите ее в новую 1,5 миллилитровую трубку. Определите количество РНК, используя метод исследователя выбора и хранить при отрицательных 80 градусов по Цельсию до дальнейшего анализа. Разбавить 10X ячейки лиза фондовый раствор 1X ячейки лиза фондовый раствор с клеточной культуры класса воды.

Восстановить ингибитор протеазы коктейль установить один с одним миллилитр воды, чтобы сделать 100X протеазы ингибитор фонда. Добавьте 100 миллилитров ингибитора протеазы в 9,9 миллилитров буфера лиза 1X-клеток, чтобы получить решение для конечного запаса 1X. Добавьте четыре микролитров буфера лиза холодных клеток на каждый миллиграмм порошка ткани и добавьте в трубку один пятимиллиметровый шарик из нержавеющей стали.

Вихрь трубки при 3000 об/мин в течение 60 секунд. Перенесите трубку на мокрый лед и продолжайте следующий образец. Кроме того, исследователи могут обнаружить, что размещение коробки вертикальной может способствовать лучшему смешиванию с бисером.

Через час центрифугировать трубки 10 000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут. Перенесите супернатанты в свежую трубку, чтобы избежать жирового слоя сверху. Определите общую концентрацию белка.

Aliquot каждый образец в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки и хранить их при отрицательном 80 градусов по Цельсию до готовности к проведению дальнейшего анализа. В этом исследовании используется криогенный метод распыления для обработки муриных лап, чтобы улучшить урожайность и качество РНК или белка, извлеченного из тканей, и дать возможность анализа молекулярных профилей, связанных с воспалительными реакциями. Репрезентативная визуализация изображения геля показывает РНК, извлеченную из передних лап мышей ЦРУ.

Диапазоны 28S rRNA и 18S rRNA указывают на то, что все образцы имеют достаточное количество нетронутой РНК. Здесь показан репрезентативный участок рассеяния общих концентраций белка на основе анализа белка BCA. Общие концентрации белка от наивных мышей, мышей ЦРУ или мышей ЦРУ под различными методами лечения сопоставимы по группам.

Затем проводятся анализы Luminex для определения концентраций воспалительных цитокинов и хемокиных в белковом экстракте. Репрезентативный участок рассеяния концентраций нормализованных цитокинов и хемокиных показывает, что по сравнению с наивными мышами, несколько цитокиных возвышенных у мышей ЦРУ и лечение анти-IL17A антитела значительно подавляет производство нескольких цитокинов. Microarray анализ проводится для оценки транскрипционных изменений в ЦРУ и связанных с лечением эффектов.

Здесь показан репрезентативный участок тепловой карты генов, значительно увеличенный у мышей ЦРУ по сравнению с наивными мышами. При выполнении этой процедуры, крайне важно для исследователей, чтобы свести к минимуму время, что трубка и порошок хранятся из сухого льда. Это помогает предотвратить оттаивание порошка и последующие проблемы с деградированной РНК и белка.

Высокое качество молекулярных подписей, генерируемых этой техникой позволяет исследователям допрашивать уникальный профиль терапевтических будет распространять и далее позволяет дифференциации механизмов, которые могут быть использованы для лечения артрита условиях. Этот метод может быть использован для извлечения ряда плотных тканей, таких как уши и кости для дальнейшей оценки молекулярных подписей в этих тканях, представляющих интерес. Понимание того, как терапия модулирует молекулярные сигнаты болезни, позволяет нам лучше оценить, какие конкретные сигнальные пути модулируются.

И, возможно, что еще более важно, какие пути не регулируются с терапевтическим механизмом оценивается. При работе с жидким азотом и сухим льдом необходимо использовать средства индивидуальной защиты, включая перчатки с надлежащей оценкой и щиты для лица. Воздействие кожи в течение более нескольких секунд может привести к серьезным ожогам.

При работе с большим количеством сухого льда важно работать в хорошо проветриваемой зоне, так как сухой лед высвобождает углекислый газ.