Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки
17 декабря 2011 г.
М клеток в специализированные фолликула связанных эпителия покрытие Пейеровы бляшки играют важную роль для слизистой иммунологического в кишечнике-лимфоидной ткани. Здесь мы описали метод оценки бактериального трансцитоза клетками М В естественных условиях. Этот метод предоставляет способ понять М-клеток в иммунной системе.
Общая цель данной процедуры — изучить захват бактерий M-клетками, расположенными в иммунной системе слизистой оболочки кишечника. Первым этапом процедуры является обнажение и лигирование пейеровых бляшек кишечника у мыши, находящейся под наркозом. Затем в лигированную область вводят флуоресцентные бактерии.
Спустя час участки с пиремизином иссекают. Затем клетки в ткани подвергают пермеабилизации и окрашиванию на маркер M-клеток GP2. Наконец, образцы исследуют с помощью конфокального микроскопа, что позволяет визуализировать бактерии, подвергающиеся трансцитозу M-клетками.
Помимо детального изучения молекулярных основ бактериального трансцитоза через M-клетки, данный метод может быть применен к другим системам. Например, этот протокол может быть использован для оценки проницаемости клеток в воспаленном кишечнике с помощью хлорформированных микробов. Используя стерильный стеклянный шпатель, посейте флуоресцентные бактерии на чашку с агаром LB и инкубируйте ее при 37 °C до появления отдельных колоний. Выберите одну колонию с плотного агара и инокулируйте ее в 2 мл свежей среды LB.
Затем культивируйте бактерии в шейкере в течение ночи при 37 °C. После того как стартовая культура вырастет, перенесите 500 µL бактерий в 4,5 mL среды LB и инкубируйте эту новую культуру при 37 °C от трех до четырех часов или до тех пор, пока ее оптическая плотность при 600 нм не достигнет единицы, что указывает на нахождение бактериального роста в логарифмической фазе. На этом этапе центрифугируйте культуру при 3000 ×g в течение пяти минут при 4 °C для сбора бактерий; после центрифугирования удалите супернатант и промойте осадок пятью mL стерильного PBS. После повторения этапа промывки ресуспендируйте бактерии в пяти mL PBS.
После введения мыши в состояние непрерывного изофлуранарного наркоза с помощью стерильных инструментов асептически раскройте брюшную полость животного. Сначала обнажите тонкий кишечник и найдите заплатки пейерова блинно-кишечного комплекса (PI's patches). После обнаружения заплаток пейеровых блинно-кишечного комплекса используйте стерильную хирургическую нить, чтобы перевязать кишечник примерно в 5 mm с одной стороны от заплатки.
Следите за тем, чтобы не повредить кровеносные сосуды во время процедуры. После перевязки кишечника с помощью шприца введите 50 µL бактериальной суспензии с концентрацией 10⁷ CFU в перевязанный участок петли кишечника со стороны свободного конца. Затем с помощью нити перевяжите кишечник с другой стороны.
Закройте брюшную полость мыши зажимом и поддерживайте состояние анестезии в течение одного часа перед эвтаназией животного. Для забора участка пейера аккуратно вырежьте его. Затем несколько раз интенсивно промойте полученный участок кишечника раствором PBS, чтобы очистить апикальную сторону участка ПП (платки Пейера) и удалить излишки слизистой жидкости и бактерий.
После промывки патча PI поместите его в лунку 24-луночного планшета и добавьте раствор cyto effects или cyto perm. Инкубируйте образец на льду в течение одного часа. После фиксации патча PI выдержите его в 1 мл буфера для промывки после пермеабилизации в течение пяти минут.
Повторите этот этап промывки трижды. Затем поместите образец в 1 mL блокирующего буфера и инкубируйте на льду в течение 30 минут. После этапа блокировки добавьте моноклональные антитела anti-mouse GP2 до конечной концентрации 5 µg/mL и инкубируйте образец в течение ночи при 4 °C для окрашивания M-клеток.
Затем промойте образец, как и раньше. Добавьте вторичный слой конъюгированных антител и инкубируйте образец на льду в темноте в течение двух часов. После окрашивания образца осторожно промойте его в PBS.
Затем поместите три или четыре круговых покровных стекла на предметное стекло и заключите фрагмент Pires в 200 µL 30% раствора глицерина в PBS. Для наблюдения за образцом на предметном стекле используйте двухфотонный конфокальный лазерный микроскоп DM IRE или микроскоп для деконволюционной реставрации Delta Vision. На данном изображении видно, что бактерии Salmonella typhimurium, меченные зеленым GFP, окружены GP2, показанным красным цветом на апикальной плазматической мембране.
На этом повернутом изображении бактерии видны внутри субапикальных цитоплазматических везикул. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как оценивать трансцитоз бактерий М-клетками с помощью анализа кишечника Lu с лигированием pyc.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол оценки поглощения бактерий М-клетками в пейеровых бляшках мыши с использованием анализа с лигированной петлей кишечника. Этот метод позволяет визуализировать и количественно определить трансцитоз бактерий М-клетками, что дает представление о слизистых иммунных ответах в кишечнике.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Микробиология
- Биология слизистых оболочек
Теоретическая часть
- Желудочно-кишечный тракт колонизирован многочисленными комменсальными бактериями и подвержен воздействию патогенов.
- Лимфоидная ткань, ассоциированная с кишечником (GALT), имеет решающее значение для иммунного ответа слизистой оболочки.
- М-клетки в Пейеровых бляшках опосредуют транцитоз антигенов из просвета кишечника в лимфоидные фолликулы.
- Gp2 является маркером и функциональным рецептором на М-клетках для определенных бактерий, включая Escherichia coli и Salmonella Typhimurium.
Цель исследования
- Разработать и продемонстрировать усовершеншенный метод анализа кишечной петли с пейеровыми бляшками мыши для оценки поглощения бактерий M-клетками.
- Визуализировать и количественно оценить трансцитоз бактерий M-клетками с помощью флуоресцентного мечения и конфокальной микроскопии.
- Способствовать пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе стимуляции слизистого иммунитета посредством M-клеток.
Используемые методы
- Подготовка и флуоресцентное мечение бактерий (например, Salmonella Typhimurium, экспрессирующих GFP).
- Хирургическая операция по лигированию петли кишечника у анестезированных мышей для изоляции Пейеровых бляшек.
- Введение флуоресцентных бактерий в петлю кишечника, содержащую Пейерову бляшку.
- Сбор, фиксация, пермеабилизация и иммуноокрашивание ткани Пейеровой бляшки с использованием антител к Gp2.
- Визуализация трансцитоза бактерий M-клетками с помощью конфокальной микроскопии.
Основные результаты
- Успешная визуализация флуоресцентных бактерий внутри M-клеток в пейеровых бляшках.
- Окрашивание на Gp2 специфически маркирует M-клетки, что позволяет идентифицировать участки захвата бактерий.
- Бактерии наблюдаются в субапикальных цитоплазматических везикулах M-клеток, что подтверждает процесс трансцитоза.
- Данный протокол позволяет определить, какие виды бактерий подвергаются трансцитозу M-клетками.
Выводы
- Улучшенный метод анализа кишечной петли эффективен для изучения поглощения бактерий M-клетками in vivo.
- Данный метод представляет собой платформу для исследования молекулярных механизмов трансцитоза антигенов и активации слизистого иммунитета.
- Этот подход может быть адаптирован для изучения других аспектов кишечной проницаемости и взаимодействий между хозяином и микробами.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественная оценка бактериального трансцитоза М-клетками в пейеровых бляшках восполняет критический пробел в понимании механизмов слизистого иммунного надзора и взаимодействий между хозяином и микробами. Данный анализ позволяет снизить механистические риски при изучении путей захвата антигенов, что повышает прогностическую достоверность на ранних этапах исследований в области иммунологии и разработки препаратов, нацеленных на микробиом. Способность метода дифференцировать виды бактерий, транспортируемые М-клетками, дает возможность валидировать мишени и проводить сортировку портфеля стратегий слизистой иммуномодуляции.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать механизмы захвата антигена, опосредованные M-клетками, в физиологически релевантной системе.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней для молекул, модулирующих слизистые иммунные ответы.
- Способствует снижению механистических рисков путем уточнения роли Gp2 и бактериальных лигандов в транцитозе.
- Обеспечивает прогностическую уверенность при продвижении иммуномодулирующих или основанных на микробиоме кандидатов.
Скрининг и разработка анализа
- Создает валидированную платформу ex vivo для количественного определения поглощения бактерий M-клетками с использованием флуоресцентной и конфокальной микроскопии.
- Обеспечивает воспроизводимое измерение событий транцитоза для различных штаммов бактерий и экспериментальных условий.
- Служит основой для стандартизации анализа при последующем скрининге модуляторов, влияющих на функцию или проницаемость M-клеток.
- Обеспечивает надежную оценку соединений-кандидатов, воздействующих на пути слизистого иммунитета.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний, релевантным для изучения взаимодействий между хозяином и микробами в слизистой оболочке кишечника.
- Обеспечивает трансляционную преемственность от этапа поиска до доклинической валидации мишеней иммунного ответа слизистых оболочек.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о продвижении кандидатов в иммунотерапевтические препараты и вакцины, нацеленные на иммунитет кишечника.
- Способствует идентификации трансляционных биомаркеров, связанных с захватом антигена, опосредованным M-клетками.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований, позволяя проверять гипотезы о поглощении антигена, поддерживая идентификацию перспективных соединений и обосновывая доклиническую валидацию модуляторов слизистого иммунитета.
- Поисковая биология: Количественная оценка транцитоза, опосредованного M-клетками, для выяснения путей захвата антигенов и снижения рисков, связанных с биологическими механизмами.
- Скрининг: Обеспечение стандартизированных количественных показателей для сравнения захвата бактерий различными штаммами и при различных воздействиях.
- Аналитика: Использование конфокальной визуализации и измерений на основе флуоресценции для статистического сравнения экспериментальных групп.
- Трансляционные исследования: Связь результатов ранних открытий с доклиническими моделями иммунитета кишечника и взаимодействия хозяина и микробов.
- Корпоративное повторное использование: Предоставление многократно используемой платформы для оценки различных видов бактерий и потенциальных модуляторов в рабочих процессах иммунологии слизистых оболочек.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней слизистого иммунитета и снижает неопределенность в понимании механизмов.
- Операционная ценность: Стандартизирует количественную оценку поглощения бактерий и обеспечивает воспроизводимость результатов в различных исследованиях.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки иммуномодулирующих и микробиом-ориентированных программ, повышая эффективность использования капитала.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию кандидатов, воздействующих на иммунные пути кишечника, с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения хирургических операций на мышах и владение методами конфокальной микроскопии.
- Необходим доступ к реагентам для флуоресцентного маркирования и инфраструктуре для визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов обработки тканей и окрашивания.
- Может потребоваться адаптация для различных видов бактерий или модельных систем.
- Пропускная способность ограничена возможностями хирургического процесса и рабочего процесса визуализации.
