Применение Мышь лигируют Патч Пейера Кишечные Пробирной Loop для оценки бактериальной поглощение М клетки

Общая цель этой процедуры заключается в изучении поглощения бактерий М-клетками, расположенными в иммунной системе слизистой оболочки кишечника. Первым шагом этой процедуры является обнажение и перевязка кишечных костров мыши, находящейся под наркозом. Затем флуоресцентные бактерии вводятся в область перевязки.

Через час участки от костров вырезают. Затем клетки в ткани проникают и окрашивают для маркера М-клеток, GP два. Наконец, образцы наблюдаются с помощью конфокального микроскопа, и можно визуализировать бактерии, трансцитозирующие М-клетками.

В дополнение к получению представления о молекулярной основе бактериального трансцитоза m-клетками, удаление может быть применено к другой системе. Например, этот протокол может быть использован для улучшения проницаемости клеток и в каркасной кишке с использованием хлора и микробов. Используя разбрасыватель из стерильного стекла, нанесите флуоресцентные бактерии на шнековую пластину LB и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока не станут видны отдельные колонии. Оторвите одну колонию от твердого шнека и внесите в нее два миллилитра свежей среды LB.

Затем культивируйте бактерии в шейкере в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. После того, как закваска вырастет, перенесите 500 микролитров бактерий в 4,5 миллилитра среды LB и инкубируйте эту новую культуру при 37 градусах Цельсия в течение трех-четырех часов или до тех пор, пока ее оптическая плотность на 600 нанометрах не достигнет единицы, указывающей на то, что рост бактерий находится в логарифмической фазе. На этом этапе центрифугируйте культуру при 3000 умноженных на G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы собрать бактерии после центрифугирования, выбросьте нац и промойте гранулу пятью миллилитрами стерильного PBS. Повторив этап промывки, восстановите суспензию бактерий в пяти миллилитрах PBS.

После того, как мышь подвергнется непрерывной анестезии изофтором, используйте стерильные инструменты для асептического вскрытия брюшной полости мыши. Начните с обнажения тонкой кишки и найдите участки ИП. После того, как пластыри ИП будут найдены, используйте стерильную швейную пряжу, чтобы перевязать кишечник примерно на пять миллиметров с одной стороны пластыря.

Следите за тем, чтобы не разорвать кровеносные сосуды во время процедуры. После того, как кишечник будет перевязан, с помощью шприца введите 50 микролитров бактериальной суспензии примерно от 10 до 7 КОЕ в петлю перевязанного костра на рыхлой стороне кишечника. Затем с помощью пряжи перевязывают другую сторону кишечника.

Закройте брюшную полость мыши зажимом и подержите мышь под наркозом в течение одного часа, прежде чем усыпить ее. Чтобы собрать урожай на участке с кострами, тщательно вырезайте участок с кострами. Затем энергично промывайте PBS через собранный участок кишечника несколько раз, чтобы промыть апикальную сторону участка PI и удалить избыток слизистой жидкости и бактерий.

После того, как пластырь PI будет промыт, поместите его в лунку 24-луночного планшета и добавьте цитоэффекты или раствор цитохимической завивки. Инкубируйте образец на льду в течение одного часа. Как только пластырь P'S будет закреплен, замочите его в одном миллилитре буфера для химической завивки на пять минут.

Повторите этот шаг стирки три раза. Затем поместите образец в один миллилитр блокирующего буфера и инкубируйте его на льду в течение 30 минут. После этапа блокировки добавьте моноклональное антитело против мыши GP two до конечной концентрации пять микрограммов на миллилитр и инкубируйте образец в течение ночи при четырех градусах Цельсия для окрашивания М-клеток.

Далее промойте пробу, как и раньше. Добавьте вторичный пол для конъюгированных антител и инкубируйте образец на льду в темноте в течение двух часов. После того, как образец окрасится, аккуратно промойте его в PBS.

Затем поместите три или четыре куска круглого покровного стекла на предметное стекло и заделайте пластырь в 200 микролитры 30% раствора глицерина в PBS. На предметном стекле используйте два конфокальных лазерных микроскопа DM IRE или деконволюционный микроскоп Delta Vision для наблюдения за образцом. На этом изображении можно увидеть, что зеленая метка GFP salmonella typhimurium окружена GP два, показанным красным цветом на апикальной плазматической мембране.

На этом повернутом изображении бактерии видны внутри субапикальных цитоплазматических везикул. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценить бактериальный трансцитоз М-клетками с помощью перевязанного кишечника