Локализация и количественная оценка бегомовирусов в тканях Whitefly с помощью иммунофлуоресценции и количественного ПЦР

Уточнение пространственности и количества вируса у переносчиков белокрылки может помочь в понимании бегомовирусно-белокрылых взаимодействий и в разработке новых стратегий борьбы с серьезными бегомовиральными заболеваниями. Преимущества этого метода в том, что мы можем быстро изолировать ткани белокрылки, совместно локализовать вирусные и белокрылки белков, а также количественно вирусов в whitefly целых тел и вирус-инфицированных растений. В соответствующую экспериментальную точку времени, после приобретения вируса, место льда анестезировал женщин белых белокрылок в каплю PBS на слайде микроскопа и использовать тонкую иглоукалывание иглы, чтобы открыть живот белокрылки под стерео микроскопом.

Используйте иглу, чтобы извлечь мидгут и поместить midgut в коллекционое блюдо PBS. Чтобы собрать PSGs, разделить тело на грудной клетке от спинной стороны рядом с головой и исправить белокрылка с иглой через грудную клетку. Используйте вторую иглу, чтобы встряхнуть белокрылки, пока две слюнные железы отделены от тела и передачи желез на новое блюдо PBS.

Чтобы собрать яичники, полностью откройте живот и используйте иглу, чтобы отделить яичники от других тканей. Используйте пипетки, чтобы удалить избыток ткани и передачи яичников в новое блюдо PBS. Чтобы собрать образец гемолита, добавьте 10 микролитров PBS на новый слайд микроскопа и поместите новую белую мухи в каплю.

Используйте тонкую иглоукалывание иглы, чтобы мягко сделать отверстие в животе. Затем нанесите небольшое давление на живот, чтобы освободить гемолитф в буфер и собрать восемь микролитров образца жидкости. Чтобы визуализировать локализацию TYLCV в собранных белокрылке PSG, midgut или тканях яичников, перенесите от 15 до 20 образцов в стеклянную 3,5-сантиметровую чашку Петри и аспирировать избыточный буфер.

Исправить ткани в один миллилитр 4%paraformaldehyde в течение двух часов при комнатной температуре, прежде чем тщательно мыть образцы три раза в течение двух минут в один миллилитр свежей TBS за стирку. После последней стирки, permeabilize образцов с одним миллилитром 0,5%Triton X-100 в течение 30 минут перед стиркой в три раза, как только что продемонстрировали с одним миллилитров TBST за стирку. После последнего мытья, блокировать любые неспецифические связывания с одним миллилитром 1%бычьей сыворотки альбумин в течение двух часов при комнатной температуре, а затем три моет в TBST, как попродемонстрировано.

После последней стирки, этикетки клеток с первичными антителами интерес ночь на четыре градуса Цельсия защищены от света. На следующее утро, мыть образцы три раза с TBST перед добавлением соответствующих вторичных антител в течение двух часов при комнатной температуре защищены от света. В конце инкубации трижды вымойте мидгуты и перенесите образцы на чистый слайд микроскопа.

Удалите как можно больше буфера и окрашиваете ядра одной каплей DAPI перед монтажом с помощью крышки и изучая помеченные ткани с помощью конфокаловой микроскопии. Для количественной оценки TYLCV, мыть собранные образцы ткани whitefly два-три раза в свежем PBS и передачи 20 midguts, 20 PSGs, или один яичник в пяти микролитров PBS в отдельных ПЦР трубки, содержащие 25 микролитров лиза раствора. Добавьте в каждую трубку керамические бусы диаметром от пяти до семи миллиметров и измельчите образцы в гомогенизаторе.

Добавьте один восемь микролитров образца гемолитфа в новую трубку ПЦР и добавьте 10 микролитров лиза в трубку с тщательным смешиванием. Инкубировать все образцы при 65 градусах по Цельсию в течение одного часа, а затем 10-минутной инкубации при 100 градусах по Цельсию и краткое центрифугирование. Затем добавьте 18 микролитров мастер-микса во флаконы количественных трубок полосы ПЦР и добавьте два микролитров каждого образца ДНК, по крайней мере, в три флакона.

Когда все образцы были загружены, закройте трубы и центрифугу, чтобы от осадки раствора в нижней части каждого флакона. Загрузите флаконы на тепловой циклер в режиме реального времени для количественного ПЦР, выбрав кибер как краситель фторфора и неизвестный в качестве образца типа. Затем экспортируют количественные данные в электронную таблицу для анализа относительного количества вирусной ДНК в каждом образце.

Здесь показаны репрезентативные изображения TYLCV в DAPI, окрашивающиеся в ПСГ, мидгуты и яичники. Как отмечается, TVLCV демонстрирует большее накопление в ПХГ и мидгутов, чем в яичниках. Количественная оценка вируса в белых ПХГ, мидгутов, гемолимф и яичников после кормления на TYLCV-инфицированных помидоров в течение 24, 48 и 72 часов указывает на то, что количество вируса увеличивается в различных тканях белокрылки в прямой корреляции с увеличением периода доступа к приобретению.

Лучше всего использовать свежих белокрылок, так как мертвые насекомые увеличат сложность вскрытия. После этой процедуры, другие анализы, как западные blotting и co-immunoprecipitation, можно выработать для того чтобы ответить дополнительные вопросы о вирусной экспрессии протеина и вирусных и взаимодействиях протеина вектора.