Методы экстракции эндосимбионтов из Белой бабочки Bemisia tabaci

Общая цель этого эксперимента — извлечь эндосимбионтов из крошечных насекомых для дальнейших экспериментов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы энтомологии и макробиологии, поскольку большинство эндосимбионтов не могут быть культивированы in vitro. Метод демонстрации выделения достаточного количества бактерий для дальнейших экспериментов очень важен.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем удобно изолировать бактериальных эндосимбионтов белокрылки. Это также может быть применено для изоляции эндосимбионтов от других насекомых, таких как тля, воронки растений и трипсы. Для начала соберите отдельную взрослую белокрылку и гомогенизируйте ее в 30 микролитрах буфера для лизиса.

Инкубируйте гомогенат при температуре 65 градусов Цельсия в течение часа. Затем 100 градусов Цельсия в течение 10 минут. Используя ДНК белокрылки и праймеры митохондиальной цитохромоксидазы 1, приготовьте 25 микролитровых ПЦР-реакций с использованием следующих реагентов.

Затем запустите ПЦР-реакции с помощью показанной здесь программы. Затем используйте набор для экстракции геля ДНК в соответствии с рекомендованным протоколом для очистки продукта ПЦР. Затем выполните анализ последовательностей в соответствии с текстовым протоколом.

Чтобы амплифицировать специфические гены каждого эндосимбионта в организме белокрылки, проведите ПЦР на ДНК белокрылки. Согласно ранее опубликованному протоколу, амплифицированный образец подвергается электрофорезу и секвенированию в агарозном геле, чтобы определить виды бактерий в белокрылке и идентифицировать специфический ген каждой бактерии. Чтобы препарировать и очистить бактериом белокрылки, добавьте 100 микролитров 1x PBS раствора на предметное стекло микроскопа.

Затем соберите нимфы третьего или четвертого возраста из листьев хлопка. И погрузить их в ПБС. Под микроскопом с помощью тонких энтомологических игл вытащите бактериомы из тела белокрылки.

Будьте осторожны при выделении бактериома, так как он маленький и хрупкий. Аккуратно вырежьте отверстие с одной стороны нимфы и слегка прижмите другую сторону, чтобы выпустить бактериомы. Затем установите микрозагрузчик объемом 20 микролитров на пипетку объемом от 0,5 до 10 микролитров и извлеките отдельный бактериом из PBS в микрозагрузчик.

Промойте бактериом, чтобы устранить загрязнение других тканей белокрылки, путем подачи бактериома в PBS и его извлечения. Повторите стирку три раза. Настоятельно рекомендуется повторить стирку, чтобы устранить как можно больше загрязнений.

Немедленно пипетируйте промытый бактериом в центрифужную пробирку, содержащую 60 микролитров PBS. Шприцем отфильтруйте собранный бактериом через фильтрующую мембрану толщиной пять микрометров. Повторите фильтрацию несколько раз, чтобы тщательно провести смешанную жидкость через мембрану.

Для амплификации фильтрата необходимо подготовить буфер D2, который будет использоваться в соответствии с рекомендованным протоколом амплификации геномной ДНК из крови или клеток с некоторыми модификациями. Непосредственно добавьте 1,5 микролитра фильтрата в центрифужную пробирку с последующим вводом 1,5 микролитра буфера D2. Хорошо перемешайте и выдержите образец на льду в течение 10 минут. Затем добавьте 1,5 микролитра стопового раствора.

Добавьте 15 микролитров реакционного буфера и один микролитр ДНК-полимеразы и аккуратно перемешайте. Инкубируйте смесь при температуре 30 градусов Цельсия в течение 16 часов, а затем при температуре 65 градусов Цельсия в течение трех минут. Проведите ПЦР непосредственно на амплифицированном фильтрате с использованием специальных праймеров, предназначенных для бактерий, чтобы подтвердить вид бактерий.

Также проведите ПЦР для подтверждения наличия загрязнения из генома хозяина с помощью праймеров для генов белокрылки бета-актина и EF1 по ранее опубликованному методу. Наконец, проведите секвенирование метагенома в соответствии с текстовым протоколом. На этом рисунке показан хлопок для выращивания белокрылки и несколько стадий развития белокрылки.

В том числе взрослая и нимфы первого, второго и четвертого возраста. Здесь представлен FISH-анализ эндосимбионтов Portiera и Hamiltonella в пределах нимфы четвертого возраста MEAM1. Наблюдается наложение двух бактерий, и обе они ограничены бактериоцитами белокрылки.

Здесь представлены изображения эндосимбионта белокрылки Portiera с помощью просвечивающей электронной микроскопии, указывающие на то, что Portiera может потерять свою клеточную стенку. После секвенирования и очистки данных о загрязнении адаптеров и дупликаций был получен полный геном облигатного симбионта Portiera. В результате получается кольцевой геном из 358, 232 пар оснований.

Кроме того, был получен проект генома гамильтонеллы, включающий 138 контигов, которые были собраны в 89 скаффолдов на основе парных концевых отношений. Как только вы освоите эту технику, ее можно будет освоить за 20 часов, если она будет выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что образцы должны быть защищены от загрязнения бактериями окружающей среды.

После этой процедуры могут быть проведены другие анализы, такие как последовательность RA и массовый бактериом, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как экспрессия генов эндосимбионтов и метаболизм. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области энтомологии и микробиологии к изучению функции эндосимбионтов у насекомых или членистоногих. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как извлекать симбионтов из бактериомов насекомых.

Не забывайте, что работа с некоторыми реагентами может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.