Exon Пропуск в непосредственно перепрограммированных Myotubes Полученные из человеческих мочи производные клетки
7 мая 2020 г.
В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышечной дистрофии мышц Дюшенна с использованием MYOD1-преобразованныхмочевых клеток для оценки восстановления дистрофин мРНК и уровня белка после пропуска экзона.
Мы установили новый протокол для прямого перепрограммирования клеток человека, полученных из мочи, в миотрубы. Это моделирование in vitro позволяет нам оценить exon пропуская в myotubes выведенных от пациента с мышечной дистрофией Duchenne. Мы обнаружили, что 3-deazaneplanocin гидрохлорид, D'nep, являются ингибитором метилтрансферазы гистона может значительно способствовать прямому скринингу UDCs в миоту в короткий промежуток времени.
Это новое аутологичное моделирование болезней на основе УДК может привести к применению точной медицины для различных мышечных заболеваний. Для начала центрифуга всей мочи составляет 400 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Далее, аспирировать супернатант оставив один миллилитр в трубке.
Resuspend гранулы индивидуально в оставшемся один миллилитр мочи. Соберите их в одну 50 миллилитровую трубку и добавьте 10 миллилитров стирального буфера в трубку. Центрифуга образцов при температуре 200 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Аспирировать супернатант оставляя 0,2 миллилитров в трубке. Повторное производство клеточных гранул в 4,5 миллилитров первичной среды. Семя клетки в трех колодцах желатина покрытием шесть скважин пластины, 1,5 миллилитров клеточной суспензии на скважину.
Культура при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. В течение трех дней добавляйте 1,5 миллилитров первичной среды каждый день. На четвертый день замените носитель 1,5 миллилитров среды роста, дополненных, как описано в рукописи.
После дня четыре, заменить дополненную среду роста через день, пока культура УДК от 80 до 90% стечения. Затем удалите среду и промыть клетки с PBS. Разделите ячейки, используя 0.25%трипсин-EDTA.
Семя клеток при плотности от 3000 до 5000 клеток на квадратный сантиметр на новый желатин покрытием 60 миллиметров блюдо. Семя UDCs на 3000 до 5000 клеток на квадратный сантиметр на желатин покрытием 60 миллиметров блюдо и поместите блюдо в инкубатор. Через 24 часа после посева, заразить клетки с разморожевания ретровируса на множественность инфекции 200.
Используйте свежую среду с концентрацией бромистого гексадиметрина 8 микрограмм на миллилитр. Инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе. Чтобы выбрать клетки, индуцированные MYOD1, замените культурную среду свежей средой роста, содержащей один микрограмм на миллилитр пуромицина.
Продолжайте менять носитель через день в течение семи-10 дней. Плита MYOD1-трансдуцированных UDCs в коллагена покрытием несколько хорошо пластины. После инкубации клеток в течение 24 часов измените средний рост на среду дифференциации, описанную в рукописи.
Затем, через три дня, измените среду дифференциации на свежую дифференциацию среды без ДЗНЕП. Продолжайте менять носитель каждые три дня. Чтобы трансфицируют антисенсовый олигонуклеотид в MYOD1-трансдуцированные UDCs, смешайте реагент аСО трансинфекции и дифференциацию среды до конечной концентрации от одного до 10 микромолеров.
И использовать эту смесь для замены среды в скважинах. Инкубировать пластину при 37 градусах По Цельсию и 5%влажности. После 72 часов инкубации с ASO, изменить средний на свежий дифференциации среды без ASO.
Через три-семь дней после трансфекции ASO удалите дифференциацию среды. Вымойте UDCs один раз с PBS и добавить буфер лиза ячейки. Урожай общей РНК с помощью комплекта извлечения РНК.
Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра. Как описано в рукописи, объединить реагенты для одношагового RT-PCR в ПЦР труб. Поместите трубки ПЦР в термоциклер и запустите термоциклер.
Выполните электрофорез микрочипа и вычислите эффективность пропуска экзона. UDCs были собраны легко и неинвазивно и сформированные колонии в пределах недели главным образом культуры. MYOD1 трансфицированных UDCs в дифференциации среды с D'Nep может сливаться друг с другом и формируется многоядерных миотрубов эффективно.
RT-PCR четко обнаружены эксон пропуск в MYOD1-UDCs, полученных от пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна. Эффективность пропуска зависит от дозы АСО. Доза-зависимых экзон пропуск был также обнаружен западной пятно.
Интенсивности дистрофина были измерены с помощью флуоресцентного микроскопа через неделю после трансфекции ASO. Заметно более высокие флуоресцентные сигналы наблюдались в MYOD1-UDCs, обработанных ASO, чем в контроле. Мы можем смоделировать любое мышечное заболевание, ведущее к пониманию патофизиологии этих заболеваний.
Обзор
В данной статье представлен протокол моделирования мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) с использованием клеток, полученных из мочи (UDCs), конвертированных с помощью MYOD1. В исследовании оценивается восстановление уровней мРНК и белка дистрофина после пропуска экзона.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследование мышечной дистрофии
Теоретические основы
- Мышечная дистрофия Дюшенна представляет собой тяжелое генетическое заболевание, характеризующееся прогрессирующей дегенерацией мышц.
- Современные методы терапии направлены на восстановление экспрессии дистрофина в мышечных клетках.
- Клетки, полученные из мочи, являются неинвазивным источником для моделирования мышечных заболеваний.
- MYOD1 — это транскрипционный фактор, который способен превращать фибробласты в миогенные клетки.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол получения миотуб из клеток, выделенных из мочи.
- Оценить эффективность пропуска экзонов в восстановлении уровней дистрофина.
- Изучить потенциал применения UDC в точной медицине при заболеваниях мышц.
Используемые методы
- Прямое перепрограммирование клеток, полученных из мочи, в миотрубки с использованием MYOD1.
- Культивирование UDC in vitro с использованием специфических сред для роста и дифференцировки.
- Трансфекция антисмысловыми олигонуклеотидами для индукции пропуска экзона.
- Оценка уровней мРНК и белка с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга.
Основные результаты
- UDC, трансдуцированные MYOD1, успешно дифференцировались в многоядерные миотрубки.
- Пропуск экзона был подтвержден с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга, что продемонстрировало дозозависимую эффективность.
- В обработанных клетках наблюдался более высокий уровень дистрофина по сравнению с контрольными.
- Данный протокол позволяет эффективно моделировать МДД и, потенциально, другие мышечные заболевания.
Выводы
- Установленный протокол является ценным инструментом для изучения DMD.
- Пропуск экзона представляет собой перспективную терапевтическую стратегию для восстановления экспрессии дистрофина.
- Данный подход может способствовать развитию прецизионной медицины при мышечных дистрофиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Прямое перепрограммирование клеток, полученных из мочи, в миотрубки позволяет осуществлять бысткое неинвазивное моделирование мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) для доклинической оценки терапии пропуска экзонов. Данный подход обеспечивает прогностическую уверенность в воздействии на мишень и функциональном восстановлении, что помогает при принятии решений на ранних стадиях формирования портфеля препаратов для прецизионной терапии нервно-мышечных заболеваний. Масштабируемость и специфичность платформы в отношении конкретного пациента делают её ценным инструментом для трансляционных исследований и разработки протоколов скрининга лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Облегчает проверку терапевтических гипотез путем моделирования мутаций DMD в миотрубках, полученных от пациентов.
- Позволяет проводить функциональную валидацию мишеней путем количественного определения восстановления дистрофина после пропуска экзона.
- Повышает прогностическую достоверность стратегий пропуска экзонов, связывая молекулярную коррекцию с экспрессией белка.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую клеточную систему для скрининга антисмысловых олигонуклеотидов и родственных соединений.
- Предоставляет количественные данные с помощью RT-PCR, вестерн-блоттинга и иммуноцитохимии для надежной разработки анализа.
- Позволяет создавать масштабируемые, специфичные для конкретного пациента платформы анализа для высокопроизводительной оценки эффективности пропуска экзонов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит клеточные модели, имеющие значение для заболевания, в соответствие с трансляционными биомаркерными конечными точками, такими как экспрессия дистрофина.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска in vitro до доклинической валидации за счет моделирования специфических ответов пациентов.
- Снижает механистическую неопределенность при оценке терапевтического эффекта путем прямого измерения восстановления функционального белка.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в континуум от поиска до доклинических исследований, обеспечивая возможность проверки гипотез, скрининга соединений и трансляционной валидации в рамках единой системы, производной от клеток пациента.
- Фундаментальная биология: позволяет проводить проверку нулевой гипотезы относительно эффективности пропуска экзонов и коррекции сигнальных путей в моделях DMD.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели для приоритизации соединений и анализа зависимости «доза-эффект».
- Аналитика: позволяет измерять эффективность пропуска экзонов и восстановления дистрофина для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки.
- Трансляционные исследования: связывает результаты in vitro с доклиническими моделями путем сопоставления клеточных показателей с биомаркерами, релевантными для данного заболевания.
- Корпоративное использование: предоставляет масштабируемую платформу многократного использования, адаптируемую к другим мышечным заболеваниям и генотипам пациентов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает биологические риски на ранних стадиях разработки нейромышечных лекарственных препаратов.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы анализа и моделирования с учетом особенностей конкретного пациента для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает обоснованное принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и экономически эффективное продвижение терапии пропуска экзонов.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию кандидатов с учетом рисков на основе функционального восстановления мишени.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, вирусной трансдукцией и методами молекулярного анализа.
- Необходим доступ к оборудованию для проведения ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинга и флуоресцентной микроскопии.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов для обеспечения воспроизводимости результатов в разных центрах и исследованиях.
- Адаптация метода к другим моделям мышечных заболеваний может потребовать оптимизации условий репрограммирования и дифференцировки.
- Эффективность и масштабируемость зависят от качества образцов пациентов и параметров трансдукции.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Isolation and Primary Culture of Urine-Derived Cells
2:31
Infection with MYOD1-Retroviral Vector
3:20
Myogenic Differentiation of MYOD1-Transduced UDCs
3:53
Evaluation of Exon Skipping Efficiency by RT-PCR
5:05
Results: Restoration of Dystrophin mRNA in UDCs
5:57
Conclusion
