Мониторинг динамики взаимодействия белок-РНК in vivo при высоком временном разрешении с использованием χCRAC

Кинетический CRAC может быть использован для изучения временных ассоциаций между РНК и РНК-связывающими белками в беспрецедентно короткие сроки. В сочетании с нашим сшивающим агентом кинетический CRAC способен сшивать живые клетки в течение нескольких секунд. Это снижает реакцию на повреждение ультрафиолетом и облегчает изучение реакций на стресс с разрешением в мельчайшем масштабе.

Kinetic CRAC — это очень длинный протокол, который может быть сложным для новых пользователей. Кроме того, работа с РНК сопряжена с определенными трудностями. Чтобы предотвратить деградацию РНК, необходимо стерилизовать все растворы с помощью фильтров и следить за тем, чтобы пипетки и лабораторный стол содержались в чистоте.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что некоторые шаги не очень интуитивно понятны. Это включает в себя УФ-сшивание и сбор клеток, а также экстракцию сшитых РНК из геля. Чтобы выполнить УФ-сшивание микроорганизмов в растворе, инокулируйте 3,5 литра нужной среды дрожжами с начальным наружным диаметром 600 0,05 и выращивайте культуру в течение ночи при 30 градусах Цельсия с непрерывным встряхиванием при 180 об/мин.

Как только клетки достигнут желаемого внешнего диаметра, влейте 500 миллилитров культуры непосредственно в сшивающий агент Vari-X-linker и облучите его 250 миллиджоулями с ультрафиолетовым излучением 254 нанометра. После сшивания используйте вакуумное фильтрующее устройство для фильтрации ячеек. Сверните мембрану с отфильтрованными ячейками, и поместите ее в 50-миллилитровую коническую трубку с маркировкой Т0. Отфильтруйте оставшиеся ячейки через шесть разных фильтров и опустите мембраны в три литра предварительно подогретой среды, вызывающей напряжение, энергично перемешивая их пипеткой в течение 50 секунд. Продолжайте сшивание клеток в объемах 500 миллилитров в нужные временные точки и храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Чтобы сшить адгезивные клетки, перенесите чашку с кварцевой культурой с клетками в специализированный лоток и облучите ее 300 миллиджоулями с ультрафиолетовым излучением 254 нанометра. Сразу же поставьте блюдо на лед. Достаньте питательную среду из посуды, и добавьте 10 миллилитров ледяного PBS. Соберите клетки путем соскабливания и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Затем гранулируйте клетки центрифугированием при 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После промывки клеток PBS снимите PBS и заморозьте гранулы клетки на сухом льду. Храните образец при температуре минус 80 градусов Цельсия по мере необходимости.

Установите центрифугу на четыре градуса Цельсия и подготовьте два ряда пробирок по 1,5 миллилитра на образец для элюирования. Быстро вращайте колонны с помощью никелевых бусин, чтобы избавиться от пустого объема. Затем поместите столбики в первый ряд элюирующих трубок, и заполните их 200 микролитрами элюирующего буфера.

Через две минуты быстро раскрутите столбики и перенесите их во второй ряд трубок. Затем повторите элюирование, как было продемонстрировано ранее. Когда закончите, соедините все элюы в пятимиллилитровой тубе и добавьте два микролитра по 20 миллиграммов на миллилитр гликогена.

Затем добавьте в образец 100 микролитров трихлоруксусной кислоты, и переведите его на вихрь в течение 30 секунд. Промыв образец ацетоном, повторно суспендируйте его в 30 микролитрах белкового буфера. Затем проверьте радиоактивность с помощью счетчика Гейгера.

Нагрейте образец в течение 10 минут при температуре 65 градусов Цельсия и загрузите в него сборный гель Bis-Tris размером от четырех до 12%. Запустите гель в течение 90 минут при напряжении 125 вольт в буфере MOPS. Когда закончите, заверните гель в пищевую пленку, и закрепите его внутри легкоплотной кассеты с помощью скотча.

После воздействия на гель автоматической рентгенографической пленки проявите пленку, срезав пищевую пленку, покрывающую гель, следя за тем, чтобы гель не перемещался и не смещал изображение. Нанесите пленку на гель и вырежьте полосу интереса. Поместите гелевый ломтик в двухмиллилитровую тубу и раздавите его наконечником для пипетки P1000.

Затем добавьте протеиназу К-буфер и протеиназу К. Инкубируйте образец при температуре 55 градусов Цельсия при энергичном встряхивании. Запустите кДНК на сборном геле 6%-ного TBE при напряжении 100 вольт в течение одного часа, используя соответствующую лестницу для количественного определения коротких фрагментов ДНК. Когда закончите, поместите гель в герметичную емкость с достаточным количеством клеточного щелочи, чтобы покрыть ее, и добавьте соответствующее количество красителя SYBR Safe.

Окрашивайте гель в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем замените буфер, содержащий SYBR, свежим клещевым энцефаловидным энцефатом. Смойте гель в течение 10 минут, слегка встряхивая.

Слейте воду из КЭ и поместите гель в прозрачную папку. Разрежьте папку до подходящего размера и нанесите на гель изображение с помощью кванта. Вырежьте фрагменты ДНК от 175 до 400 пар оснований и поместите гелевый кусочек в пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Разбейте гель наконечником для пипетки P1000 и добавьте 400 микролитров воды. Затем инкубируйте его в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, встряхивая. Заморозьте образец на сухом льду на 10 минут.

Затем повторите инкубацию при 37 градусах Цельсия. Вставьте два стеклянных фильтра из микрофибры внутрь фильтрующей колонны, помещенной в трубку. Затем с помощью отрезанного наконечника для дозатора P1000 перенесите гелевую суспензию TBE в фильтрующий блок и уменьшите ее до 17 000 G в течение 30 секунд.

Этот протокол был использован для мониторинга взаимодействий Nrd1-РНК в дрожжевых клетках, подвергшихся воздействию глюкозодефицитной среды. Образцы сшивали до перехода в среду без глюкозы, а также через одну, две, четыре, восемь, 14 и 20 минут после. Авторентгенограммы эксперимента показали интенсивный сигнал на ожидаемой молекулярной массе Nrd1, представляющий собой белок, связанный с короткими радиомечеными РНК, не поддающимися секвенированию.

Сигнал над этой полосой, который представляет собой белок, сшитый с более длинными фрагментами РНК, был выделен. Для внесения изменений в протокол кинетического CRAC для клеток млекопитающих был разработан специальный этап, позволяющий проводить ультрафиолетовое облучение посуды с адгезивными клетками. Эффективность этой установки измерялась путем сшивания и захвата стабильно помеченных GFP RBM7.

Сшивающий агент смог восстановить комплексы белковой РНК из клеток млекопитающих с помощью ультрафиолетового облучения 254 нанометра с эффективностью, сравнимой с широко используемым устройством для ультрафиолетового облучения. Разработка УФ-проницаемой кварцевой чашки Петри во время сшивания еще больше усилила восстановление белковых РНК-комплексов. Данные Nrd1 показывают, что белок связывается со многими некодирующими РНК-транскриптами, что указывает на то, что он участвует в деградации этих транскриптов.

Также было продемонстрировано связывание с транскриптами, кодирующими HXT6 и HXT7, которые активируются во время глюкозного голодания. Кинетический CRAC позволяет измерять динамические взаимодействия между белковыми РНК во время развития клеток, стрессовых реакций и сборки макромолекулярных комплексов, таких как рибосома или сплайсосома.