Руководство по секционной обработке, корингу и обработке изображений для закупок и анализа образцов высокой пропускной способности кортикальной кости для синхротронной микро-CT

Имеющиеся данные, связанные с получением образцов костей для синхротронной микрокомпьютерной томографии, остаются скудными. Наше подробное руководство предлагает простую, минимально разрушительную и экономичную методологию. Получение образцов костей с постоянными размерами и цилиндрической формой имеет решающее значение для обеспечения высочайшего качества получаемых наборов данных и применимости результатов.

Методы, описанные в этой рукописи, применимы к отбору керна из горных пород, окаменелостей или любого другого твердого материала. Мы использовали их для сбора кернов одинакового размера горных пород и монокристаллов для экспериментов под высоким давлением, чтобы исследовать реологию земной коры и верхней мантии. Начинающие пробники могут обнаружить, что костный образец образует конические формы.

Эту проблему можно решить, предусмотрев достаточное время для вымывания костной пыли из бурового долота и замедлив скорость отбора керна. Не хватает обучающих текстов и видео, которые демонстрируют получение образцов костей для синхротронной микрокомпьютерной томографии и логического анализа. Наш пошаговый урок по подготовке кости поможет восполнить этот пробел.

Поместите предметное стекло микроскопа размером 75 на 25 миллиметров на горячие пластины с температурой до 140 градусов Цельсия и расплавьте большое количество термоэпоксидной смолы в центре предметного стекла. Вдавите нижнюю часть костного блока в термическую эпоксидную смолу на предметном стекле микроскопа длиной кости перпендикулярно предметному стеколу. Перемещайте образец вперед и назад, чтобы покрыть нижнюю часть кости и обеспечить надежное сцепление.

Дайте установленному образцу постоять на горячей пластине примерно пять минут, чтобы термоэпоксидная смола проникла в поры и трещины, убедившись, что эпоксидная смола на предметном стекле не содержит пузырьков. Если пузырьки присутствуют, перемещайте образец вперед и назад, чтобы удалить их. С помощью тупых щипцов снимите предметное стекло с установленным образцом с горячей плиты и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение примерно 10 минут, затем удалите эпоксидную смолу с края предметного стекла с помощью бритвенного лезвия, чтобы убедиться, что патрон адекватно захватывает предметное стекло.

Прикрепите предметное стекло с прилипшим образцом к патрону со стеклянным предметным стеклом и установите патрон на поворотный рычаг тихоходной секционной пилы, расположив его таким образом, чтобы поперечное сечение кости можно было разрезать перпендикулярно ее длине. Отрегулируйте поворотный рычаг, чтобы убедиться, что лезвие соприкасается с образцом и пересекает его. Добавьте грузы на дальнюю сторону режущего рычага, чтобы противостоять весу рычага, и добавьте дистиллированную воду и смазочно-охлаждающую жидкость в емкость для жидкости.

Плотно закрепите алмазное межвафельное лезвие и убедитесь, что уровень жидкости погружается в режущую часть лезвия. Установите скорость на 200 об/мин и медленно опустите образец на лезвие. Как только пила начнет резать, убедитесь, что лезвие и патрон не шатаются и не подпрыгивают.

Если они есть, немедленно остановите пилу и затяните лезвие или рычаг патрона в сборе. Если патрон агрессивно движется вверх и вниз, добавьте больше противовесов. Первый толстый участок представляет собой отработанный срез, который обеспечит четко определенную поверхность, параллельную каждому дополнительному разрезу.

После первоначального среза отходов поднимите поворотный рычаг и переместите патрон на пять миллиметров к лезвию с помощью диска позиционирования. После завершения секции поместите предметное стекло с установленным образцом на горячую пластину, чтобы расплавить термоэпоксидную смолу. Закрепите пять миллиметровых костяных секций на дно неглубокой алюминиевой жести, используя ранее описанную технику термического эпоксидного соединения.

Поместите жестяную форму на двухкоординатный стол сверлильного станка и вручную затяните крепежные зажимы. Вставьте двухмиллиметровый внутренний диаметр полого вала ювелирного алмазного сверла с алмазным наконечником в патрон фрезерного сверла и отрегулируйте ограничитель глубины, чтобы предотвратить попадание керна через олово. Выровняйте центральную переднюю часть образца кости под сверлом, избегая при этом тесного контакта с надкостницей и устьем или участками с высокой трабекуляризацией.

Наполните жестяную банку дистиллированной водой, чтобы полностью покрыть образец, что предотвращает накопление тепла, пригорание образца и повреждение бурового долота во время отбора керна. Сверлильный станок может быть опасным, если не будут приняты надлежащие меры безопасности. Операторы должны убедиться, что они носят защитные очки, что свободная одежда надежно закреплена, а длинные волосы отведены назад, чтобы они не застряли в веретене.

В течение первых нескольких случаев контакта между коронкой и костью приложите мягкое давление, чтобы надеть кольцо на верхнюю поверхность кости. Это предотвращает прогиб бурового долота в начале процесса отбора керна и обеспечивает правильную установку долота. Во время отбора керна поднимайте буровую коронку внутрь и из пробы, удерживая кончик коронки ниже поверхности воды.

Делайте это каждые несколько секунд, чтобы смыть попавшую в ловушку костную пыль и убедиться, что мусор не засоряет сверло. После завершения отбора керна полученная костная сердцевина может застрять в сверле с полым стержнем. Используйте пару щипцов с тонким наконечником или небольшой шестигранный ключ, чтобы выбить стержень из биты.

Храните образец с керном в маркированной микроцентрифужной пробирке в прохладном и сухом месте до получения изображения. Описанный метод отбора керна показал себя высокоэффективным и результативным. Здесь приведены репрезентативные цифры, сравнивающие процесс обработки изображений образца с керном и образца, полученного с помощью вращающегося инструмента.

Образец, срезанный с помощью обычного вращающегося инструмента, показал увеличенное количество каналов и лакун, а также уменьшение среднего диаметра канала, объема канала и пористости коры головного мозга по сравнению с образцом с керном. В этой таблице приведены данные о пористости для каждого образца. Несмотря на то, что протокол отбора керна уменьшает артефакты, наблюдаемые при синхротронной микрокомпьютерной томографии, более низкое качество артефактов в экспериментах с прямолинейными костными блоками представляет собой многогранную проблему.

Последующая обработка изображений подтвердила потенциал методики для улучшения визуализации микроархитектуры кортикальной кости. Например, наблюдались различия в минерализации, улучшенное очерчивание остеональных границ и последовательная визуализация мягких тканей в сосудистых каналах. Медленные действия являются ключом к получению цилиндрических образцов одинакового размера.

Слишком быстрое движение может привести к тому, что образцы станут конусообразными, а не цилиндрическими. При получении толстых срезов для отбора керна, дополнительные толстые срезы могут быть собраны для светлопольной или конфокальной микроскопии. Это позволяет визуализировать сеть каналов.