Использование компьютерной томографии высокого разрешения для визуализации трехмерной структуры и функции сосудистой завод

Общая цель этой процедуры заключается в использовании технологии рентгеновской микротомографии на основе синхротрона для изучения структуры и функции сосудистого транспорта в растениях. Это достигается путем предварительной подготовки образцов для установки в держатель патрона или держатель для активного растения, обеспечение максимальной вертикальности сканируемой части и проведение необходимых предварительных физиологических измерений. Вторым шагом является помещение подготовленных образцов или живых растений в контейнер A LS Beamline 8.3 0,2 и закрепление контейнера для сканирования. Следующий.

После правильного позиционирования образца начинается сканирование. Последним шагом является использование рабочих станций для нормализации, реконструкции и оценки качества сканирования перед передачей данных в VISO для процесса 3D-визуализации. В конечном счете, рентгеновская микротомография используется для выявления мельчайших деталей взаимосвязей и функционального состояния проводящей воду сосудистой сети у растений.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как серийное срезирование и световая микроскопия, заключается в том, что растительные ткани могут быть исследованы в любой ориентации с беспрецедентным разрешением. Этот метод может помочь нам понять ключевые вопросы в области биологии растений, от фундаментальных аспектов переноса воды в растениях до засухи и устойчивости к замерзанию до того, как патогены систематически перемещаются в растениях-хозяевах. Данный протокол, как описано, предназначен для работы с усовершенствованным источником света.

8.3 0.2. Для работы на других синхротронных установках может потребоваться адаптация лучевой линии. Обязательно пройдите обучение по технике безопасности и радиации, необходимое для использования этих установок, чтобы начать подготовку образцов для живых установок.

Сначала выращивайте растения в горшках диаметром примерно 10 сантиметров, следя за тем, чтобы главный стебель или другая часть растения, подлежащая сканированию, была максимально центрирована и ориентирована вертикально в горшке. Физические размеры прибора HRCT Hutch ограничивают живые растения примерно одним метром в высоту. Как следствие, визуализацию живых растений лучше всего проводить на рассаде или саженцах.

При выращивании в небольших горшках используйте изготовленный на заказ жесткий алюминиевый держатель для крепления живых горшечных растений. Высота верхней плиты должна быть отрегулирована в соответствии с диапазоном высоты горшка. Здесь верхняя часть пластины спроектирована так, чтобы выровняться с верхней поверхностью почвы, а растение выступает из центра двухкомпонентной пластины.

После установки в держатель измерьте водный потенциал стебля с помощью напорной камеры типа посадочного модуля SHO или параметра листа, чтобы определить физиологическое состояние растения перед сканированием. Скрутите небольшой кусочек медной проволоки вокруг стебля, чтобы он служил в качестве фидуциария, чтобы обеспечить постоянное расположение сканирования на растениях, которые будут сканироваться повторно. Теперь поместите тонкостенный акриловый цилиндр над растением поверх алюминиевого держателя растения и закрепите его на месте винтами для стабилизации образца.

Дополнительные пластиковые оберточные бумажные полотенца и скотч должны использоваться для дальнейшей минимизации вибрации и движения частей растения, которые могут привести к искажению изображения. Прикрепите специальный подстаканник к предметному столику с воздушным подшипником и зафиксируйте его на месте между источником рентгеновского излучения и датчиком изображения и оборудованием камеры. Обязательно расположите стебель как можно более вертикально и центрируйте образец на основании магнитного патрона, чтобы он оставался в поле зрения Во время вращения свежий растительный материал, обычно стебли или домашние животные, можно сканировать после немедленного извлечения из живого растения.

Если цель эксперимента состоит в том, чтобы визуализировать всю сеть ксилемы, вода внутри сосудов должна быть сначала откачана и заменена воздухом. Для этого смонтируйте образец в барокамере и протолкните сжатый воздух или азот через образец под низким давлением в течение примерно пяти минут. Виды будут отличаться временем, необходимым для эвакуации сети судов.

Если цель состоит в том, чтобы оценить степень образования эмболии в свежей растительной ткани, удалите образцы из растения с помощью свежего бритвенного лезвия, делая надрезы под водой. Затем оберните образец слоем параформы, чтобы предотвратить высыхание во время сканирования, установите образец в сверлильный патрон, закрепленный на металлической пластине, ввинченной в центр предметного столика с воздушным подшипником, и ориентируйте образец вертикально, как описано ранее, чтобы образец оставался в поле зрения. Готовить образцы из высушенной древесной ткани начинают с вырезания образцов примерно до шести сантиметров в длину.

Отбирайте образцы, которые находятся как можно более прямыми в целевой области сканирования и имеют диаметр около одного сантиметра. Следующим шагом является медленное обезвоживание всего образца для обеспечения оптимальной визуализации образца ткани и контраста изображения. Поместите образец древесной ткани в сушильный шкаф при низкой температуре, чтобы медленно высушить образец, не вызывая растрескивания или расщепления ткани.

В некоторых ситуациях может быть желательно иметь фидуциарный маркер, прикрепленный к образцу. Это гарантирует, что последующее препарирование и визуализация с использованием сканирующей электронной микроскопии могут быть ориентированы на определенные точки изображения HRCT. Для этого прикрепите металлическую или стеклянную бусину или проволоку к внешней стороне стебля с помощью парфюмерии.

Наконец, установите образец в сверло для проверки и центрируйте, как описано выше, перед сканированием. Определите увеличение, которое лучше всего подходит для вашей области применения. Используемый здесь A LS Beamline 8.3 0.2 позволяет сканировать с помощью линз с увеличением два x пять x и 10 x.

Установите рентгеновскую энергию на 15 килоэлектронвольт. Время экспозиции, как правило, зависит от толщины и плотности образца и составляет от 100 до 1000 миллисекунд. Выберите угловое приращение, подходящее для вашего приложения.

Во время сканирования образцы поворачиваются на 180 градусов, и количество изображений, полученных во время вращения, может оказать значительное влияние на размер набора данных, продолжительность интервала сканирования и итоговое качество изображения. Типичное сканирование выполняется с шагом 0,25 градуса, что дает 513 изображений за сканирование. Более короткие интервалы сканирования могут быть достигнуты с помощью настройки непрерывной томографии, во время которой образец непрерывно вращается, пока изображения захватываются для каждого сканирования, также необходимо собирать изображения светлого и темного поля.

Светлопольные изображения — это изображения без образца в луче. Они часто собираются до и после сканирования образца путем горизонтального переноса образца. Темные поля собираются при закрытии рентгеновского затвора.

Он измеряет количество сигнала, который камера показывает без рентгеновского излучения. После завершения сканирования перенесите необработанные изображения в формате 2D TIFF с компьютера на файловый сервер, а затем экспортируйте на компьютер для обработки данных. Далее изображения должны быть преобразованы в процентную шкалу пропускания.

Beamline 8.3 0.2 имеет пользовательский плагин нормализации фона, который можно загрузить и использовать с бесплатными программными пакетами. Image J или Fiji загружает нормализованные изображения в программный пакет octopus, а затем реконструирует набор 3D-данных из файлов 2D-изображений TIFF, используя указанные шаги обработки. Далее стек изображений можно визуализировать в одном из множества программных пакетов.

Здесь используется программный пакет aviso, который загружает наборы данных в системную память и отображает образец в виртуальной поперечной, продольной или радиальной ориентации среза Благодаря 3D-атрибутам набора данных виртуальные срезы через образец можно поворачивать в любой плоскости для выравнивания с интересующими областями. После того, как сегментация завершена, можно количественно оценить целевые структуры растений или функциональные изменения в объеме, длине, ширине, наличии или отсутствии воды, воздуха и т.д. Синхротронное сканирование HRCT было успешно реализовано на самых разных тканях и видах растений с использованием Beamline 8.3 0.2 и позволило получить новое представление о структуре и функциях ксилемы растений с беспрецедентным разрешением в 3D.

Возможности визуализации и исследования, предоставляемые 3D-реконструкциями, как показано здесь, позволяют точно определять местоположение и ориентацию структур с помощью сетей Xylem как на образцах акциза, так и на живых растениях. Здесь мы видим 3D-реконструкцию стебля секвойи, подвергшегося воздействию засухи и демонстрирующего как воздушные, так и водные трахи. Другие методы, такие как сканирующая электронная микроскопия, могут быть использованы для проверки структур, которые мы видим внутри растений, и определения пороговых значений размера, которые затем вводятся в программы обработки, которые мы используем для анализа данных.