April 5th, 2013
Высокое разрешение рентгеновской компьютерной томографии (КТВР) является неразрушающим методом диагностики визуализации, которые могут быть использованы для изучения структуры и функции сосудистой завода в 3D. Мы показываем, как КТВР облегчает изучение ксилемы сети в широком диапазоне тканей растений и видов.
Общая цель этой процедуры заключается в использовании технологии рентгеновской микротомографии на основе синхротрона для изучения структуры и функции сосудистого транспорта в растениях. Это достигается путем предварительной подготовки образцов для установки в держатель патрона или держатель для активного растения, обеспечение максимальной вертикальности сканируемой части и проведение необходимых предварительных физиологических измерений. Вторым шагом является помещение подготовленных образцов или живых растений в контейнер A LS Beamline 8.3 0,2 и закрепление контейнера для сканирования. Следующий.
После правильного позиционирования образца начинается сканирование. Последним шагом является использование рабочих станций для нормализации, реконструкции и оценки качества сканирования перед передачей данных в VISO для процесса 3D-визуализации. В конечном счете, рентгеновская микротомография используется для выявления мельчайших деталей взаимосвязей и функционального состояния проводящей воду сосудистой сети у растений.
Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как серийное срезирование и световая микроскопия, заключается в том, что растительные ткани могут быть исследованы в любой ориентации с беспрецедентным разрешением. Этот метод может помочь нам понять ключевые вопросы в области биологии растений, от фундаментальных аспектов переноса воды в растениях до засухи и устойчивости к замерзанию до того, как патогены систематически перемещаются в растениях-хозяевах. Данный протокол, как описано, предназначен для работы с усовершенствованным источником света.
8.3 0.2. Для работы на других синхротронных установках может потребоваться адаптация лучевой линии. Обязательно пройдите обучение по технике безопасности и радиации, необходимое для использования этих установок, чтобы начать подготовку образцов для живых установок.
Сначала выращивайте растения в горшках диаметром примерно 10 сантиметров, следя за тем, чтобы главный стебель или другая часть растения, подлежащая сканированию, была максимально центрирована и ориентирована вертикально в горшке. Физические размеры прибора HRCT Hutch ограничивают живые растения примерно одним метром в высоту. Как следствие, визуализацию живых растений лучше всего проводить на рассаде или саженцах.
При выращивании в небольших горшках используйте изготовленный на заказ жесткий алюминиевый держатель для крепления живых горшечных растений. Высота верхней плиты должна быть отрегулирована в соответствии с диапазоном высоты горшка. Здесь верхняя часть пластины спроектирована так, чтобы выровняться с верхней поверхностью почвы, а растение выступает из центра двухкомпонентной пластины.
После установки в держатель измерьте водный потенциал стебля с помощью напорной камеры типа посадочного модуля SHO или параметра листа, чтобы определить физиологическое состояние растения перед сканированием. Скрутите небольшой кусочек медной проволоки вокруг стебля, чтобы он служил в качестве фидуциария, чтобы обеспечить постоянное расположение сканирования на растениях, которые будут сканироваться повторно. Теперь поместите тонкостенный акриловый цилиндр над растением поверх алюминиевого держателя растения и закрепите его на месте винтами для стабилизации образца.
Дополнительные пластиковые оберточные бумажные полотенца и скотч должны использоваться для дальнейшей минимизации вибрации и движения частей растения, которые могут привести к искажению изображения. Прикрепите специальный подстаканник к предметному столику с воздушным подшипником и зафиксируйте его на месте между источником рентгеновского излучения и датчиком изображения и оборудованием камеры. Обязательно расположите стебель как можно более вертикально и центрируйте образец на основании магнитного патрона, чтобы он оставался в поле зрения Во время вращения свежий растительный материал, обычно стебли или домашние животные, можно сканировать после немедленного извлечения из живого растения.
Если цель эксперимента состоит в том, чтобы визуализировать всю сеть ксилемы, вода внутри сосудов должна быть сначала откачана и заменена воздухом. Для этого смонтируйте образец в барокамере и протолкните сжатый воздух или азот через образец под низким давлением в течение примерно пяти минут. Виды будут отличаться временем, необходимым для эвакуации сети судов.
Если цель состоит в том, чтобы оценить степень образования эмболии в свежей растительной ткани, удалите образцы из растения с помощью свежего бритвенного лезвия, делая надрезы под водой. Затем оберните образец слоем параформы, чтобы предотвратить высыхание во время сканирования, установите образец в сверлильный патрон, закрепленный на металлической пластине, ввинченной в центр предметного столика с воздушным подшипником, и ориентируйте образец вертикально, как описано ранее, чтобы образец оставался в поле зрения. Готовить образцы из высушенной древесной ткани начинают с вырезания образцов примерно до шести сантиметров в длину.
Отбирайте образцы, которые находятся как можно более прямыми в целевой области сканирования и имеют диаметр около одного сантиметра. Следующим шагом является медленное обезвоживание всего образца для обеспечения оптимальной визуализации образца ткани и контраста изображения. Поместите образец древесной ткани в сушильный шкаф при низкой температуре, чтобы медленно высушить образец, не вызывая растрескивания или расщепления ткани.
В некоторых ситуациях может быть желательно иметь фидуциарный маркер, прикрепленный к образцу. Это гарантирует, что последующее препарирование и визуализация с использованием сканирующей электронной микроскопии могут быть ориентированы на определенные точки изображения HRCT. Для этого прикрепите металлическую или стеклянную бусину или проволоку к внешней стороне стебля с помощью парфюмерии.
Наконец, установите образец в сверло для проверки и центрируйте, как описано выше, перед сканированием. Определите увеличение, которое лучше всего подходит для вашей области применения. Используемый здесь A LS Beamline 8.3 0.2 позволяет сканировать с помощью линз с увеличением два x пять x и 10 x.
Установите рентгеновскую энергию на 15 килоэлектронвольт. Время экспозиции, как правило, зависит от толщины и плотности образца и составляет от 100 до 1000 миллисекунд. Выберите угловое приращение, подходящее для вашего приложения.
Во время сканирования образцы поворачиваются на 180 градусов, и количество изображений, полученных во время вращения, может оказать значительное влияние на размер набора данных, продолжительность интервала сканирования и итоговое качество изображения. Типичное сканирование выполняется с шагом 0,25 градуса, что дает 513 изображений за сканирование. Более короткие интервалы сканирования могут быть достигнуты с помощью настройки непрерывной томографии, во время которой образец непрерывно вращается, пока изображения захватываются для каждого сканирования, также необходимо собирать изображения светлого и темного поля.
Светлопольные изображения — это изображения без образца в луче. Они часто собираются до и после сканирования образца путем горизонтального переноса образца. Темные поля собираются при закрытии рентгеновского затвора.
Он измеряет количество сигнала, который камера показывает без рентгеновского излучения. После завершения сканирования перенесите необработанные изображения в формате 2D TIFF с компьютера на файловый сервер, а затем экспортируйте на компьютер для обработки данных. Далее изображения должны быть преобразованы в процентную шкалу пропускания.
Beamline 8.3 0.2 имеет пользовательский плагин нормализации фона, который можно загрузить и использовать с бесплатными программными пакетами. Image J или Fiji загружает нормализованные изображения в программный пакет octopus, а затем реконструирует набор 3D-данных из файлов 2D-изображений TIFF, используя указанные шаги обработки. Далее стек изображений можно визуализировать в одном из множества программных пакетов.
Здесь используется программный пакет aviso, который загружает наборы данных в системную память и отображает образец в виртуальной поперечной, продольной или радиальной ориентации среза Благодаря 3D-атрибутам набора данных виртуальные срезы через образец можно поворачивать в любой плоскости для выравнивания с интересующими областями. После того, как сегментация завершена, можно количественно оценить целевые структуры растений или функциональные изменения в объеме, длине, ширине, наличии или отсутствии воды, воздуха и т.д. Синхротронное сканирование HRCT было успешно реализовано на самых разных тканях и видах растений с использованием Beamline 8.3 0.2 и позволило получить новое представление о структуре и функциях ксилемы растений с беспрецедентным разрешением в 3D.
Возможности визуализации и исследования, предоставляемые 3D-реконструкциями, как показано здесь, позволяют точно определять местоположение и ориентацию структур с помощью сетей Xylem как на образцах акциза, так и на живых растениях. Здесь мы видим 3D-реконструкцию стебля секвойи, подвергшегося воздействию засухи и демонстрирующего как воздушные, так и водные трахи. Другие методы, такие как сканирующая электронная микроскопия, могут быть использованы для проверки структур, которые мы видим внутри растений, и определения пороговых значений размера, которые затем вводятся в программы обработки, которые мы используем для анализа данных.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
В этой статье рассматривается использование высокоразрешающей рентгенографической компьютерной томографии (HRCT) для исследования структуры и функции сосудистой системы растений в трех измерениях. Метод позволяет детально исследовать сети ксилемы в различных растительных тканях и у разных видов растений.
High-resolution computed tomography (HRCT) enables non-destructive 3D visualization of plant vascular systems, offering a powerful tool for mechanistic de-risking in early-stage target validation. By revealing fine structural and functional details of xylem networks, HRCT supports predictive confidence in understanding vascular transport mechanisms relevant to drought tolerance, pathogen resistance, and systemic signaling. This capability aids in prioritizing biological targets and pathways with translational relevance to crop improvement and stress resilience.
HRCT fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly in studies focused on vascular function, stress adaptation, and systemic signaling in plant models.