Протокол иммуногистохимии и распределения РНК in-situ в раннем эмбрионе дрозофилы

Как организм с коротким гестационным периодом, эмбрионы Drosophila melanogaster являются основными объектами исследования для изучения распределения и локализации белков и их регуляторов в процессе развития. Однако из-за их богатых липидами эмбрионов и богатых хитином хорионов их полезность ограничена сложностью установки эмбрионов на стеклянные поверхности. В этой работе мы представляем практический метод, который значительно усиливает прикрепление эмбриона дрозофилы на слайдах и подробно описываем наши методы успешной гистохимии, иммуногистохимии и гибридизации in-situ.

Перед этапами, показанными здесь, слайды следует промыть моющим средством, затем промыть в водопроводной воде и дистиллированной воде перед тем, как поместить их в духовку для сушки. Сухие горки следует осторожно замачивать в дихромате калия в течение 24 часов, прежде чем снова промыть и высушить, а затем поместить в 95% этанол в течение не менее двух часов. На этом этапе вы можете подготовить дополнительные слайды или хромированный квасц-желатин в соответствии с нашими методами.

Желатин затем можно хранить в 60-градусной воде для ванны перед использованием. Чтобы покрыть слайды, опустите небольшое количество желатина на один край слайда. Затем используйте еще один стеклянный слайд, чтобы медленно и равномерно перетащить желатин по поверхности слайда, подлежащего покрытию.

Это создает тонкий, ровный слой. Перед помещением в стеллаж или сушильный аппарат хранить в духовке, чтобы обеспечить полную сушку в течение еще одной ночи или 48 часов. Эмбрион собираются с помощью агаровой пластины виноградного сока, после того, как она готова, пластина агара виноградного сока затем может быть удалена.

Наполните пластину PBS и аккуратно смажьте мягкой щеткой, чтобы удалить все прикрепленные эмбрионы. Удалите эмбрион, содержащий PBS, в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку и дайте отдохнуть на льду. После того, как эмбрион поселится на льду, аккуратно удалите надосадочный PBS.

Будьте осторожны, чтобы не потревожить эмбрион в нижней части трубки. Добавьте 1 мл 50% отбеливателя в образец и осторожно встряхните в течение двух минут. Удалите отбеливатель путем фильтрации и промыть эмбрионы в PBS три раза.

Готовят н-гептан. После готовности вымойте эмбрионы из фильтровальной бумаги в н-гептан, аккуратно встряхнув фильтровальную бумагу в растворе. Позвольте эмбрионам осесть на дне н-гептановой пластины и соберите этот н-гептан в новую 1,5-миллилитрную центрифужную трубку.

Добавьте один миллилитр метанола в пробирку, дайте раствору выпасть в осадок, а затем аспирировать н-гептан метанол. Промыть эмбрион в PBS три-пять раз, чтобы удалить остаточный метанол. Удалите этот лишний PBS и добавьте фиксатор Буэна и дайте оседнуть в течение 30-60 минут, чтобы зафиксировать эмбрионы.

Удалите фиксирующее средство Буэна и снова вымойте эмбрионы в PBS три раза. Подготовьте 1,2% агарозы в PBS и согрейтесь на 60-градусной водяной бане, а затем подготовьте эмбрионы к встраиванию, осторожно аспирируя дополнительный PBS, в котором он хранился. Осторожно, чтобы не потревожить эмбрионы на дне, а затем аспирировать эмбриональную пробку на дне раствора и аккуратно поместить в форму крышки бутылки.

Аспирируйте любой дополнительный PBS из этой формы перед добавлением 1,2% агарозного геля. Приготовьте раствор PBS для хранения этих агарозных пробок. Как только агароза затвердеет, отдельные вилки могут быть перемещены в эту PBS для хранения.

Здесь мы показываем последовательный процесс обезвоживания. 15 минут для инкубации каждый раз. Затем вынуть из 100% этанола и зафиксировать в одном растворе этанола и ксилола еще на 15 минут.

После удаления из этого индивидуального раствора удалите чистый ксилол в течение одной минуты. Теперь образец ткани готов к перемещению в подогретый раствор ксилол-парафина один к одному. Дайте постоять в течение 30 минут до окончательного встраивания в 100% парафин.

Перейдите к первому из 100% парафина и отдохните в течение двух часов. Повторите этот процесс в двух и трех парафинах. Теперь образец готов к перемещению в форму, а форма заполнена воском для завершения процесса встраивания.

Встраивание эмбрионов дрозофилы. Поместите подготовленные парафиновые срезы эмбрионов дрозофилы в 60-градусную духовку на 15 минут. Поместите их в 100%-ный раствор ксилола.

Затем мы начинаем регидратацию. Поместите слайды в каждое из этих решений на три минуты каждый. Как только горка окажется в дистиллированной воде, поместите в раствор гематоксилина на две минуты.

После завершения убедитесь, что вы сливаете как можно больше раствора с слайда. После того, как горка была промыта в дистиллированной воде, затем окрасьте горку в эозин в течение одной минуты. Наконец, снимите горку с эозина и смойте в дистиллированной воде.

Как только этот слайд будет очищен, мы начнем наш окончательный процесс обезвоживания. Наконец, помещают в 100% ксилол на пять минут. Этот процесс повторяют в двух новых растворах из 100% ксилола и капают небольшое количество нейтральной камеди вдоль одного края горки.

Возьмите этот скольжение крышки и аккуратно расположите его на одном краю слайда. Сначала депарафинизируйте слайды, поместив в 100% ксилол. После того, как горки будут удалены из дистиллированной воды, их следует покрыть 1% периодическим раствором кислоты.

Затем мы выбрасываем лишний раствор и промываем в дистиллированной воде. Помещая слайд непосредственно в предварительно нагретый раствор. Как только это будет завершено, мы промываем горку в дистиллированной воде, а затем окрашиваем раствор 0,2% хлоридом золота в течение одной-двух минут.

Далее мы фиксируем ткань 3% тиосульфатом натрия в течение трех минут, используя дистиллированную воду. А затем противопоставляется гематоксилином. После вскрытия пятно можно промыть любой трубкой дистиллированной воды, как показано здесь.

Затем переходим к процессу обезвоживания. Следуйте этому, помещая слайды непосредственно в 100% ксилол, а затем нанесите небольшое количество нейтральной резинки на угол слайда. Аккуратно накройте крышкой.

Начните подготовку слайдов, как и ранее, путем депарафинизации и ксилола. А затем в один ксилолэтанол. Как только слайды депарафинизированы, мы начинаем регидратацию их ткани и затем, наконец, в PBS.

Поместите слайды в 0,3% перекиси водорода, изготовленной в метаноле, в течение 10 минут. Затем слайды покрываются 20 мл целевого поискового раствора. Затем слайды можно поместить в ящик для окрашивания.

Поместите ящик окрашивателя в пароварку, гарантируя, что раствор не выйдет, а слайды все еще полностью покрыты. Обратите внимание, что крышка пятнистого ящика не должна быть полностью закрыта, чтобы водяной пар мог выходить во время процесса пропаривания. А затем аккуратно промыть PBS-T три раза.

Выбросьте лишний раствор и повторите процесс, на этот раз с PBS. Затем мы инкубируем слайды в блоке перекиси в течение пяти-10 минут, а затем снова промываем несколько раз в PBS-T, а затем в PBS. Подготовьте антитело и опустите непосредственно на ткань.

Затем эти ткани могут быть инкубированы или при комнатной температуре в течение четырех часов. Вторичное антитело следует инкубировать при комнатной температуре в течение 90 минут, что окрашивается 5% DAB в течение двух-10 минут. После получения соответствующего цвета промыть в дистиллированной воде, а затем противопачкать гематоксилином.

После этого пятна гематоксилина слайды могут быть последовательно обезвожены. Поместите горки в 100% ксилол и дайте впитаться в течение трех минут. Затем капните небольшое количество нейтральной резинки на один край слайда.

После того, как резинка была помещена, возьмите крышку слайда и аккуратно поместите с одного края слайда. Добавьте один микрограмм очищенной линеаризованной шаблонной ДНК в стерильный флакон без РНКазы. Затем добавьте достаточное количество стерильной обработанной DEPC двойной дистиллированной воды, чтобы получить общий объем образца 13 микролитров.

Затем ненадолго центрифугируют и инкубируют в течение двух часов при температуре 37 градусов Цельсия. Для экспериментов по защите от РНКазы мы рекомендуем инкубировать в течение 15 минут с двумя микролитрами Днк-1, без РНКазы для удаления шаблонной ДНК. Как только стадия инкубации будет завершена, остановите реакцию, добавив два микролитра 0,2 молярной ЭДТА при рН восьми.

До того, как шаги показали здесь, слайды были депарафинизированы и регидратированы, в соответствии с нашим ранее продемонстрированным протоколом. После регидратации инкубируют слайды по 0,01 моль на литр PBS при рН 7,4 в течение пяти минут каждый для удаления фиксирующего раствора из ткани. После полоскания в PBS мы затем промываем 100 миллимолярами на литр раствора глицина в течение пяти минут дважды, чтобы удалить свободные альдегидные группы из ткани.

После этого шага промойте слайды PBS в течение пяти минут. Далее инкубируют в PBS, содержащем 0,3%тритона X-100, в течение 15 минут до промывки, а затем снова инкубируют с одним микрограммом на микролитр протеиназы K.Далее зафиксируйте слайды с 4%-ным параформальдегидом и PBS при рН 7,2 в течение трех минут. Затем промыть слайды перед инкубацией с 0,1 молярным триэтаноламиновым буфером рН 8, содержащим 0,25% уксусного ангидрида.

На этом этапе вы можете наклонить коробку, чтобы обеспечить полное покрытие решением. Коробку готовят путем добавления 20% глицерина или воды DEPC на дно сухой гибридизационной коробки. Далее накрываем слайды 20 микролитрами раствора предварительной гибридизации.

ДНК сперматозоидов лосося в концентрации 100 мкг на миллилитр к каждому слайду. А затем инкубировать при 42 градусах Цельсия в течение четырех часов. Это делается в предварительно подготовленной увлажненной коробке, чтобы гарантировать, что раствор не высохнет во время этого процесса.

На этапе после гибридизации очень важно, чтобы решение гибридизации было полностью смыто из ваших образцов. Это может быть сделано в последовательных полосканиях продолжительностью 15 минут при 37 градусах, используя четырехкратную концентрацию SSC, двукратную концентрацию, одну раз концентрацию, 0,5-кратную концентрацию и 0,1-кратную концентрацию раствора SSC. Каждый насиживается в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

После этого промыть PBS три раза в течение пяти минут перед добавлением буфера для стирки. Буфер для стирки следует промыть в течение одной минуты перед следующими шагами Убедитесь, что буфер для стирки полностью высох от слайдов, прежде чем добавлять следующий раствор. Добавьте 100 миллилитров блокирующего раствора к каждому слайду и высиживайте слайд в течение 30 минут.

Это лучше всего делать в свободной от света среде, чтобы обеспечить хорошее окрашивание. Далее инкубируют слайды в течение 30 минут снова в 20 мл раствора антител. Нанесите раствор антител непосредственно на слайды для полного покрытия вашей ткани.

После того, как инкубация будет завершена, нанесите 100 миллилитров промывочного буфера. Инкубировать в течение 15 минут в свободных от света условиях для удаления несвязанных конъюгатов антител. Снимите буфер для стирки.

Далее применяют 20 миллилитров детекторного буфера и дают инкубировать в течение примерно четырех минут. Через четыре минуты удалите буфер обнаружения. Высушите слайды, чтобы не было дополнительного раствора, и добавьте 10 миллилитров свежеприготовленного раствора цветной подложки.

Эта реакция начинается в течение нескольких минут, но завершается через 16 часов. Поэтому дайте инкубировать в течение этого периода времени в легком свободном состоянии. Как только нужные места, где обнаружены полосы, промывают слайд 50 миллилитрами буфера TE, чтобы остановить реакцию.

А затем завершите наш ранее показанный процесс обезвоживания и процесс монтажа для нейтральной резинки. На рисунках первом и втором показан метод покрытия хром-алюминиевым желатиновым покрытием для парафиновых срезов и метод встраивания профиля экспрессии FKBP12 и DmFKBP12 при развитии эмбрионов дрозофилы. На рисунке третьем показано белковое распределение антител, обнаруженных FKBP12 на синцитиальных клеточных бластодермных стадиях.

Из этих гистохимических результатов видно, что экспрессия FKBP12 менее поляризована в синцитиальной бластодерме, а затем начинает локализоваться в базальной мембране под эпителием трофэктодермы, информируя градиент с большей экспрессией, обнаруженной в переднем и заднем полюсах. На рисунке четыре, который следует за ранней и поздней стадиями газового отношения эмбриона дрозофилы, показано, что белок FKBP12 становится ограниченным определенными архитектурными компонентами примитивной эмбриональной ткани. С меньшим внеклеточным распределением, чем наблюдается на ранних и поздних гастроэмбриональных стадиях.

Интересно, что описанное выше динамическое распределение белка не сопровождается соответствующими изменениями уровней МРТ FKBP12, как показано на рисунке пять. Указание на экспрессию белка является результатом все еще неизвестного посттранскрипционного молекулярного механизма. Передача сигналов кальция, опосредованная рецептором рянодина, является фундаментальным путем во многих физиологических и патологических процессах как позвоночных, так и беспозвоночных животных.

Известно, что мутации в этом гене вызывают многие физиологические нарушения, приводящие к болезни или ранней сердечной смерти. Однако роль, которую этот ген играет в раннем развитии дрозофилы, было трудно изучить. Как транзитный компонент эмбриона, богатый липидами эмбрион и богатый хитином хорион затрудняют изучение белка и эмбриональной экспрессии в раннем развитии дрозофилы.

Скользящее покрытие, встраивание эмбрионов и иммуногистохимические методы, описанные в этой статье, позволили нам подробно изучить динамическое распределение белка и мРНК рецептора рианодина. Мы разделяем эти методы и надеемся, что они позволят другим изучать другие белки на ранних стадиях развития дрозофилы.