Мульти-кий биореактор для оценки воспалительной и регенеративной способности биоматериалов в потоке и растяжении

До сих пор было очень сложно выявить причинно-следственные связи между гемодинамикой и регенерацией сосудистой ткани. И это связано с тем, что контролировать отдельные механические нагрузки сложно. Этот биореактор позволяет нам механически исследовать индивидуальные и комбинированные эффекты чистого напряжения и циклического растяжения на регенеративный потенциал широкого спектра тканеинженерных сосудистых трансплантатов.

Демонстрировать эту процедуру будет Сюзанна Кох, кандидат наук в нашей группе. И доктор Тамар Виссинг, научный сотрудник нашей лаборатории. Чтобы закрепить электроспиральный каркас на силиконовой трубке, проденьте проленовый шов 4-0 в один конец куска силиконовой трубки и из другого.

Завяжите небольшой узел с обеих сторон трубки, оставив примерно 10 сантиметров проволоки на обоих узлах, и сделайте третий узел поверх двух. После снятия иглы для наложения швов обрежьте края силиконовой трубки в треугольную форму и сделайте окончательный узел на конце двух 10-сантиметровых проволок. Окуните электроспиральный каркас в 30% этанол и поместите каркас на один конец свободной шовной проволоки.

Затем осторожно растяните обе стороны силиконовой трубки и 10-сантиметровый шовный узел, в то время как второй исследователь использует пинцет с гладким внутренним кончиком, чтобы аккуратно натянуть электроспиральный каркас на трубку. Медленно отпустите натяжение силиконовой трубки, одновременно разглаживая электровращающийся каркас пинцетом. И окуните каркас и силиконовую трубку в ультрачистую воду два раза.

Соорудите нижнее отделение и убедитесь, что уплотнительное кольцо установлено правильно. Поместите переходную втулку в верхнюю часть нижнего отсека и пропустите напорный трубопровод с отверстиями через нижний отсек. Зашнуруйте силиконовое уплотнительное кольцо вокруг нижнего конца напорного трубопровода, чтобы предотвратить утечку.

И прикрутите нижнюю часть нижнего отсека к верхней части нижнего отсека, чтобы закрепить напорный трубопровод. Убедитесь, что нижняя гравированная канавка напорного трубопровода находится примерно на три-пять миллиметров выше края втулки адаптера нижнего отсека. Натяните силиконовую трубку с электроспиральным каркасом на напорный трубопровод и сделайте кивок и шовную проволоку на нижнем конце электроспирального каркаса, в месте выгравированной канавки на напорном трубопроводе.

Сделайте второй кивок на противоположной стороне, чтобы плотно закрепить силиконовую трубку с помощью электроспирального трансплантата. И, поместив ножничный зажим, оснащенный правилом, на верхний конец силиконовой трубки, последовательно потяните ножничный зажим вверх и аккуратно потяните за электрические нерестовые леса, чтобы удалить любые складки. С помощью шовной проволоки сделайте два узла на обоих концах каркаса в верхней гравированной канавке напорного трубопровода.

Когда оба узла будут завязаны, отпустите зажим ножниц и с помощью ножа удалите излишки силиконовых трубок. Прикрутите носовые конусы к резьбе напорных трубопроводов для образцов, которые будут динамически нагружаться. Окуните напорный трубопровод, трубки и каркас один раз в 30% этанол и два раза в сверхчистую воду, чтобы предварительно намочить установку.

Поместите стеклянную трубку над напорным трубопроводом и осторожно надавите на нижний отсек, чтобы зафиксировать стеклянную трубку на месте. Затем поместите выпрямитель потока, силиконовое уплотнительное кольцо и переходную втулку в верхний отсек. И закрепите отсек над открытым торцом стеклянной трубки.

Извлеките штекер приманки из проточного отверстия, работайте в стерильном ламинарном шкафу. Откройте белую крышку приманки и положите салфетку для пропитки этанолом перед выпускным отверстием. Разберите проточную камеру культуры, сняв стеклянную трубку с верхним отсеком.

Поместите вакуумную пастбищную трубу, добавьте ее на электровращающиеся леса, чтобы удалить как можно больше среды. И добавьте раствор фибриногена в соотношении один к одному с клеточной суспензией, дополненной тромбином. Подайте раствор пипеткой вверх и вниз по одному разу и сразу же капните раствор по всей длине каркаса.

Когда все клетки будут доставлены, медленно перемещайте каркас слева направо, вверх и вниз, чтобы добиться равномерного распределения ячеек. Когда обе стороны каркаса будут засеяны, тщательно реконструируйте проточную камеру для посева, поместив стеклянную трубку и верхний отсек обратно. И поместите проточную камеру для культивирования в инкубатор, чтобы волокно застыло.

Чтобы соединить биореактор с насосной системой, поместите проточную камеру для культивирования на одну из восьми винтовых резьб на основании биореактора. И поместите зажим хоста на трубку среднего размера. Снимите белую крышку приманки, закрывающую входное отверстие верхнего отсека камеры проточной культуры, и снимите гнездовую муфту приманки средней трубки.

Подсоедините трубку среднего уровня с одной стороной впускного отверстия в верхнем отсеке. А другая сторона с выходом потока в нижнем отсеке. Перенесите полную комплектацию из шкафа с ламинарным потоком в инкубатор.

И соедините жидкостные агрегаты и основание биореактора с напорной трубкой воздуха и электрическим кабелем. Запустите программное обеспечение и инициализируйте насосы. Запускайте поток среды для образцов один за другим.

Затем измените параметры тензометрического насоса на нужные настройки и запустите деформацию. Следите за растяжением, применяемым к лесам через день. Мониторинг напряжения растяжения и сдвига стенки в течение долгосрочных периодов культивирования показывает, что эти значения могут поддерживаться на относительно постоянных уровнях в течение периода до 20 дней.

После трех дней гемодинамической нагрузки иммунофлуоресцентное окрашивание выявляет однородное распределение моноцитарных макрофагов и миофибробластов по всему скаффолду. После 20 дней совместного культивирования циклическое растяжение приводит к отложению более многочисленных и толстых волокон коллагена 1-го типа. В то время как в группе комбинированной гемодинамической нагрузки циклический эффект растяжения перекрывается чистым стрессом, что приводит к менее выраженному отложению коллагена 1-го типа.

После восьми дней монокультуры макрофагов эрозия волокон и расщепление волокон наблюдаются во всех режимах гемодинамической нагрузки, при этом наиболее выраженная резорбция наблюдается в статической группе, а наименее выраженная резорбция наблюдается в группе с чистым стрессом. Как циклическое растяжение, так и явный стресс влияют на профиль секреции цитокинов в кокультуре. Интересно, что комбинированные эффекты обеих нагрузок демонстрируют либо доминирование одной из двух нагрузок, либо синергетические эффекты обеих нагрузок.

Эксперименты по совместному культивированию также показывают, что механическая среда и результирующая воспалительная среда, зависящая от нагрузки, модулируют фенотип миофибробластов. Кроме того, паттерны экспрессии генов сократительного маркера альфа гладкомышечного актина коррелируют с синтезом белка. Самое важное при выполнении этого протокола - это то, что при использовании stretch, важно, чтобы ваша установка была без утечек.