Визуализация клеточной адаптации легких во время комбинированного озона и ЛПС-индуцированного острого повреждения легких
21 марта 2021 г.
Комбинированные мыши, подвергшиеся воздействию озона и бактериального эндотоксина, демонстрируют широко распространенную гибель клеток, в том числе нейтрофилов. Мы наблюдали клеточные адаптации, такие как нарушение цитоскелетной ламеллиподии, повышенная клеточная экспрессия комплекса V АТФ-синтазы субъединиц β и ангиостатина в бронхо-альвеолярном лаваже, подавление иммунного ответа легких и задержка набора нейтрофилов.
Привет, меня зовут Гурприт. Наша лаборатория исследует механизмы воспаления и восстановления легких. Привет, меня зовут Джессика, и я исследую озоноиндуцированные лабораторные альвеолы крыс с помощью флуоресцентных микроскопических методов.
Привет всем, меня зовут Манприт. И я изучаю воспаление легких с помощью методов визуализации животных. Легкие постоянно сталкиваются с прямыми и косвенными оскорблениями, возникающими из-за стерильных, таких как озон, и микробных компонентов, таких как бактериальный липополисахарид или ЛПС.
Подавляющая реакция хозяина может привести к скомпрометированному дыханию и острому повреждению легких, характеризуясь рекрутированием нейтрофилов легких из-за нерегулируемого иммунного, коагулятивного и тканевого ремоделирования хозяина. Описан комплексный анализ различных компартментов, а именно бронхо-альвеолярной лаважной жидкости, то есть БАЛ, легочной сосудистой перфузата, то есть ЛВП, криоотсеков левого легкого, периферической крови и грудинного и бедренного костного мозга. Для воздействия озона осторожно поместите мышей в специальный индукционный ящик и непрерывно подвергайте мышей воздействию 0,05 PPM озона в течение двух часов.
Для воздействия ЛПС обезболивают мышей под легкой внутрибрюшинной смесью кетамина и ксилазина. Теперь закапывайте 50 микролитров из раствора LPS во внешние нары мышей. Закапывать контрольным мышам 50 микролитров стерильного физиологического раствора.
В указанные моменты времени обезболивают мышей полной дозой смеси кетамина и ксилазина. Затем продезинфицируйте мышей и проверьте на педальные рефлексы, то есть зажмите любой из пальцев задних конечностей, и наблюдайте за втягиванием конечности. Отсутствие рефлекса означает глубокую анестезию.
Теперь сделайте разрез ниже грудины и обнажите сердце. Поместите иглу 25 калибра, прикрепленную к гепаринизированному шприцу, в правый желудочек и проколите кровь путем пункции сердца. Соберите кровь в гепаринизированные шприцы и слейте в микрофьюж-пробирки для дальнейшей обработки.
Осторожно используйте пинцет или тупые щипцы, чтобы очистить область трахеи от вышележек. Теперь прорежьте грудную клетку, чтобы обнажить легкие. Пропустите ватную лигатуру ниже трахеи, и оставьте ее такой на время.
Отрежьте трахею, расположенные примерно на одной трети ее длины от легких для трахеостомии. Вставьте полиэтиленовую канюлю 28 калибра в трахею. Плотно завяжите хлопчатобумажную лигатуру, чтобы удерживать канюлю на месте.
Убедитесь, что вы не сворачиваете канюлю. Теперь постепенно вводят 0,5 мл PBS в канюлю с помощью одного мл шприца. После инъекции PBS аспирировать шприц до тех пор, пока он не сопротивляется всасыванию.
Соберите аспирированную жидкость в меченую микрофаговую трубку и повторите эту процедуру еще два раза. Отрежьте нисходящую грудную аорту в месте между грудной и брюшной половинами, чтобы избежать любого резервирования во время перфузии легких. Промокните полость возле разрезанной аорты, свободной от крови.
Далее перфузировать легкие 0,5 мл гепаринизированного физиологического раствора комнатной температуры, ввести его через правый желудочек. Соберите сосудистую перфусат из полости на разрезаемом конце нисходящей грудной аорты. После перевязки правого бронха дайте левому легкому надуться 0,5 мл параформальдегида в течение пяти минут.
Теперь продезинфицируйте брюшную часть. Отрежьте брюшную часть и отрежьте ее от тазовой кости. Соберите тазовую кость и изолируйте левую и правую бедренные кости в заполненной физиологическим раствором чашке Петри, храняшейся на льду.
Соберите вентральную грудную клетку и грудину в наполненную физиологическим раствором чашку Петри, которая также хранится на льду. Срежьте срезанные концы костей четыре раза 0,5 мл физиологического раствора с помощью хорошо подогнанных игл на шприцах по 1 мл. Соберите фракции из каждой кости в помеченные трубки Falcon, снабженные фильтрами и помещенные на лед.
Центрифугировать все образцы в течение 10 минут при 3000 об/мин. Соберите супернатанты и заморозьте их. Воссоздайте клетки минимум в 200 микролитрах PBS.
Выполните общий подсчет лейкоцитов. Окрашивайте другую жидкость BAL смесью зеленого кальцеина и красного гомодимера этидия одним пятном. Проанализируйте супернатант на хемокины и общую концентрацию белка.
Центрифугировать клетки, чтобы подготовить два цитоспина на каждом слайде и окрашивание для биохимических и иммунных белков. Выполняйте модифицированное окрашивание H и E на криосекциях легких для всех групп. Вручную нарисуйтесь от 150 до 200 ячеек на объединенной панели изображений.
Скопируйте обозначенные области, представляющие интерес, во все каналы. Измерьте заданные параметры для всех каналов. Разделите флуоресцентную интенсивность окрашенной молекулы на интенсивность DAPI или CD61.
Они называются нормализованными коэффициентами интенсивности флуоресцентной мощности DAPI или CD 61. Затем настройте график параметров для оценки любых изменений после экспозиции. Хотя комбинированное воздействие не индуцировало каких-либо изменений в общем количестве клеток BAL, LVP или грудины костного мозга, мыши демонстрировали системный лейкоцитоз через 24 часа, за которым следовала лейкопения через 72 часа после воздействия.
Они отображаются в количестве клеток периферической крови. Количество клеток бедренного мозга показывает поздний всплеск через 72 часа по сравнению со всеми временными точками. Обратите внимание на отсутствие окрашивания Siglec-F и CX3CRI в полиморфноядерных клетках через 24 часа на изображении BAL цитоспина.
Цитоспины BAL и LVP показали наличие больших CD11b и GR1 положительных мононуклеарных клеток в нулевые часы. Полиморфонядерные клетки представлены как преобладающий тип клеток во всех компартментах после воздействия. Общее содержание белка BAL было самым высоким через 36 часов после комбинированного воздействия.
Тем не менее, белок LVP не изменился после воздействия. Уровни эотаксина-2 и интерлейкина-2 были самыми высокими в течение четырех часов в LVP. Эти хемокины были уменьшены во фракции BAL.
Интересно, что нейтрофильные сигналы IL-16 и многие врожденные хемокины были изменены в LVP, но не во фракции BAL. На исходном уровне более 95% клеток BAL были моноядерными, показывающими кортикальные актиновые, ламеллиподии, стрессовые и тубулиновые волокна, и они были сильно положительными для снижения окрашивания митотрекером. Через четыре часа мы наблюдали круговые клетки BAL, которые потеряли актин, но показали растянутую сеть микротрубочек, как показано красным цветом и более низким уменьшением окрашивания митотрекера.
В начале после комбинированного воздействия клетки BAL оказались вдвойне положительными для гомодимера кальциина и этидия-1, что указывает на частично скомпрометированные клетки. Через 36 часов клетки BAL были в значительной степени жизнеспособными, то есть зелеными. Мы наблюдали дискретное окрашивание АТФ альфа и Ly6G в альвеолярных макрофагах BAL и нейтрофилах.
Мы наблюдали снижение DAPI нормализованного альфа АТФ и увеличение содержания внутриклеточного белка Ly6G. Комбинированное воздействие индуцировало переходные экспрессии Bal, естественной клетки-киллера и K1.1, нейтрофильной АТФ, субъединитги PETA, фактора пролиферации, Ki-67 и устойчивых экспрессий нейтрофилов GR1, тромбоцитов CX3CRI и антиангиогенного белка ангиостатина в клетках BAL после воздействия. Хотя ожидалось повреждение бронхиолярной и альвеолярной перегородки, было удивительно наблюдать клеточные агрегаты в более крупных сосудах через 36 часов после воздействия.
Наконец, в этой таблице у нас есть результаты обобщения. Мы надеемся, что наша мышиная модель послужит легкодоступным прототипом, который может быть воспроизведен в лабораториях сдерживания второго уровня для изучения механизмов инвазивной гибели клеток и инфекций. Спасибо.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование изучает влияние комбинированного воздействия озонов и бактериальных эндотоксинов на воспаление легких и клеточные реакции у мышей. Основные выводы включают широкое распространение клеточной гибели, особенно нейтрофилов, и заметные клеточные адаптации.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Биология дыхания
Бакground
- Озон и бактериальные липополисахариды (ЛПС) известны тем, что они вызывают воспаление легких.
- Понимание клеточных реакций на эти воздействия важно для разработки терапевтических стратегий.
- Нейтрофилы играют значительную роль в иммунном ответе в легких.
- Клеточные адаптации могут указывать на степень тяжести воспаления и потенциальные механизмы восстановления.
Цель исследования
- Оценить влияние воздействия озонов и эндотоксинов на жизнеспособность клеток легких.
- Исследовать механизмы воспаления и восстановления легких.
- Определить конкретные клеточные адаптации в ответ на комбинированное воздействие.
Использованные методы
- Животная модель с мышами, подвергающимися воздействию озона и бактериального эндотоксина.
- Оценка клеточной гибели и иммунного ответа через бронхо-альвеолярное лаважи.
- Флуоресцентные микроскопические методы для анализа клеточных изменений.
- Измерение экспрессии белков, связанных с воспалением и клеточной функцией.
Основные результаты
- Было наблюдено широкое распространение клеточной гибели, особенно нейтрофилов.
- Отмечено нарушение цитоскелетных ламеллиподий в пораженных клетках.
- Обнаружена повышенная экспрессия субъединицы V АТФ-синтазы и ангиостатин.
- Подавление иммунного ответа легких и задержка нейтрофильной рекрутации были значительными находками.
Выводы
- Комбинированное воздействие озона и эндотоксина приводит к серьезному повреждению клеток легких.
- Клеточные адаптации могут отражать попытки справиться с воспалительным стрессом.
- Понимание этих механизмов может помочь в разработке будущих терапевтических подходов для болезней легких.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This murine model of combined ozone and LPS-induced acute lung injury provides a controlled system to interrogate inflammatory pathways and cellular stress responses relevant to environmental toxicology and immunomodulator screening. The approach enables quantitative visualization of neutrophil dynamics, chemokine gradients, and cytoskeletal remodeling across multiple compartments, supporting mechanistic de-risking of pulmonary-targeted candidates. By capturing delayed immune responses and biomarker co-localization (e.g., ATP synthase subunits, angiostatin, Ly6G), the method offers predictive value for target engagement and pathway modulation in preclinical safety assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TLR4-mediated pathways and oxidative stress mechanisms in neutrophil recruitment and alveolar macrophage dysfunction.
- Operational Value: Provides multiplexed readouts (viability, chemokine levels, protein expression) from BAL fluid, lung tissue, and bone marrow to de-risk targets affecting pulmonary inflammation.
- Scientific Value: Supports functional validation of targets involved in cytoskeletal remodeling, mitochondrial function, and extracellular matrix interactions under combined insult conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantifiable outputs such as DAPI-normalized fluorescent intensity ratios for ATP synthase subunits and Ly6G, enabling assay reproducibility across laboratories.
- Operational Value: Facilitates screening of immunomodulatory agents by tracking delayed leukocyte kinetics (leukocytosis at 24h, leukopenia at 72h) and chemokine gradients (eotaxin-2, IL-16) in vascular and alveolar compartments.
- Scientific Value: Allows assessment of compound effects on subcellular structures (actin, tubulin, mitochondrial membrane potential) via co-staining with Mitotracker and cytoskeletal markers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links acute lung injury models to systemic responses through bone marrow perfusate analysis, supporting translational biomarker discovery for emergency myelopoiesis.
- Operational Value: Enables longitudinal monitoring of cellular adaptations (e.g., sustained angiostatin, transient Ki-67) to inform dosing schedules and therapeutic windows in preclinical studies.
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system to evaluate compounds targeting coagulative pathways (e.g., plasminogen/angiostatin axis) or neutrophil extracellular trap formation in sterile-inflammatory settings.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing to preclinical efficacy screening, particularly for modifiers of neutrophil-driven lung injury and stromal-immune crosstalk.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating variables such as ozone dose (0.05 ppm) and LPS delivery (50 µL intranasal) to attribute observed cellular changes to specific inflammatory triggers.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with quantifiable endpoints including chemokine concentrations (eotaxin-2, IL-16), protein expression (GR1, CX3CR1), and viability metrics (calcein/ethidium homodimer ratios).
- Analytics: Enables statistical comparison of normalized fluorescent intensity ratios across time points and compartments, facilitating objective assessment of compound-induced shifts in cellular adaptation.
- Translational Research: Connects alveolar macrophage and neutrophil responses to bone marrow output, informing preclinical decisions on myeloid-targeted interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse pulmonary insults (pollutants, pathogens, therapeutics) using standardized fluorescent microscopy and compartmental sampling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by revealing mechanistic links between oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and neutrophil activation in lung injury.
- Operational Value: Promotes standardization through defined protocols for tissue harvest, cytospin preparation, and multi-channel imaging, reducing inter-lab variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early biomarkers of maladaptive repair (e.g., persistent angiostatin, cytoskeletal collapse) before functional decline manifests.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on ability to modulate delayed neutrophil responses and chemokine gradient resolution in multi-compartmental models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques (cardiac puncture, tracheostomy, bone marrow perfusion) and fluorescent microscopy.
- Dependent on cryostat, centrifuge, and multispectral imaging infrastructure for cryosection and cytospin analysis.
- Necessitates cross-team harmonization of staining panels (e.g., DAPI/CD61 normalization, Mitotracker, Ly6G) to ensure data comparability across studies.
- Must account for model-specific variables such as murine strain sensitivity to ozone and LPS, and circadian timing of sample collection.
- Limited by endpoint nature of tissue harvest; longitudinal intravital imaging would require complementary approaches for real-time tracking.
