Экспланты опухолей, полученные от пациентов, как «живая» доклиническая платформа для прогнозирования лекарственной устойчивости у пациентов
7 февраля 2021 г.
В этой статье описываются методы генерации, медикаментозного лечения и анализа эксплантов, полученных от пациента, для оценки реакций на лекарства от опухоли в живой, соответствующей пациенту, доклинической модельной системе.
Экспланты, полученные от пациента, являются краткосрочным методом, обеспечивающим немедленные данные о реакции на лекарства, которые могут точно прогнозировать результаты лечения пациентов. Платформы PD позволяют исследовать лекарственные реакции в 3D-контексте, который максимально точно отражает патологические и архитектурные особенности регионарных опухолей. Экспланты могут предложить новое понимание метаболизма и механизма действия лекарственного средства и облегчить идентификацию новых фармакодинамических биомаркеров.
Перед началом эксперимента очистите все хирургическое оборудование 70% раствором промышленных метилированных спиртов. Наполните 10-сантиметровое культуральное блюдо 25 миллилитрами свежей среды на льду. Используя пинцет, перенесите образец на поверхность зубного воска и используйте два лезвия кожного трансплантата, чтобы разрезать ткань на фрагменты размером примерно два-три кубических миллиметра.
Переложите экспланты в 10-сантиметровую посуду и поместите шесть-девять кусочков ткани в одну миллилитровую трубку, содержащую 10% небуферизованный раствор формалина для 24-часовой инкубации при комнатной температуре. Заполните нужное количество лунок шестилуночной плиты 1,5 миллилитрами свежей среды на скважину. И поместите в каждый колодец органотипическую культурную тарелку, чтобы она плавала поверх среды.
Поместите от шести до девяти эксплантов на каждый вставной диск и храните в течение 16 часов в инкубаторе 5% углекислого газа, чтобы обеспечить восстановление. На следующий день добавьте свежую среду и препарат в каждую лунку новой тарелки. Включите колодец для управления транспортным средством.
Когда все лекарственные средства будут приготовлены, используйте пинцет для переноса одной вставки в каждую лунку новой пластины из шести лунок для инкубации от 24 до 48 часов в инкубаторе углекислого газа. После лечения препаратом перекладывают диски в новые шесть луночных пластин, содержащих 10% формалина. И добавьте несколько капель 10% формалина в верхнюю часть каждого экспланта, чтобы обеспечить полное покрытие фиксатором в течение 24 часов инкубации при комнатной температуре.
На следующий день замочите соответствующее количество небольших гистологических губок в 70% промышленном метилированном растворе. И поместите губки внутрь гистологических кассет. Когда все губки будут помещены, переместите все экспланты из того же состояния лечения лекарством на одну губку с обработанной препаратом стороной каждой эксплантации, контактирующей с вставленным диском.
Поместите еще одну предварительно замоченную губку поверх каждого экспланта и закройте кассету, чтобы закрепить экспланты в кассете. Затем погружают кассеты в 70% промышленный метилированный раствор, прежде чем приступать к гистологической обработке. После сканирования выполните обучающий анализ и загрузите сканы, содержащие штампы для обучения, в соответствующее программное обеспечение для анализа.
В однорежимном представлении перемещайтесь по изображениям и выбирайте сканы для анализа и сканирования с внутренней флуоресценцией. При внутреннем флуоресцентном сканировании в одном представлении щелкните автофлуоресцентный выбор, чтобы нарисовать сегмент на участке незапятнанной ткани. Щелкните Изменить маркеры и цвета и введите имена маркеров в поле, связанном с каждым флуорофором.
Нажмите кнопку Подготовить изображения, чтобы позволить программному обеспечению вычесть интенсивность внутренней флуоресценции из всех загруженных изображений. Щелкните шаг сегмента ткани в верхней части экрана, чтобы открыть окно тренировки сегментации тканей. На панели «Категории тканей» введите название каждой категории тканей, подлежащей сегментации.
Нажмите кнопку Нарисовать, чтобы нарисовать области вокруг групп клеток в интересующей категории тканей. Затем переключитесь на следующую категорию тканей и нарисуйте новые области. Когда все области обучения будут определены, используйте сегментатор тканей тренировки и подождите, пока точность обучения установится.
Возможно до значения, близкого к 100%Нажмите сегментировать все, чтобы сегментировать ткани. После проверки качества сегментации тканей щелкните сегментацию клеток и выберите клеточные компартменты для сегментации. Чтобы настроить ядерный компонент, используйте ползунок типичной интенсивности для настройки порогового значения, используемого для обнаружения ядерных пикселей.
Обратная связь в реальном времени предоставляется окном предварительного просмотра. Чтобы разделить кластеры ядерных пикселей, на панели разделения ядерных компонентов выберите кнопку, которая лучше всего описывает качество окрашивания ядер, и используйте ползунок для настройки чувствительности к расщеплению. Затем щелкните Сегментировать все, чтобы сегментировать все изображения.
Когда все изображения будут сегментированы, на панели фенотипов добавьте список фенотипов, которые необходимо обнаружить, и введите имя фенотипов в соответствующее текстовое поле. Нажмите редактировать фенотипы, чтобы выбрать определенную ячейку и выбрать соответствующий фенотип в раскрывающемся меню. После завершения отбора для обучения нажмите на классификатор поездов, чтобы оценить результат каждого фенотипа.
Перейдите к фенотипу всех, сохраните проект и нажмите экспорт. Выберите вкладку пакетного анализа и загрузите проект в пакетный алгоритм или поле проекта. Чтобы экспортировать изображения и таблицы, выберите все поля в параметрах экспорта, нажмите кнопку Добавить слайды и загрузите все изображения, содержащие штампы для ранее подготовленных пакетов.
Затем нажмите кнопку «Запустить», чтобы начать пакетный анализ одного штампа и экспортировать соответствующие данные, когда они были получены. Мультиспектральная визуализация эксплантной ткани НМРЛ, окрашенной для маркеров жизнеспособности клеток, позволяет идентифицировать и фенотипировать отдельные клеточные популяции, а также идентифицировать опухолевые и стромальные компоненты в микросреде экстраплантной опухоли. Тканевая и клеточная сегментация пятен маркера жизнеспособности клеток мультиспектральных изображений, как показано на рисунке, может быть использована для количественной оценки гибели и пролиферации клеток в эксплантатах, полученных пациентами, обработанными препаратами, представляющими интерес.
Например, в этом анализе в образцах тканей из опухолей, обработанных ниволумабом, было идентифицировано большее количество умирающих клеток по сравнению с контрольными образцами опухоли. Кроме того, как показано на рисунке, способность извлекать пространственную информацию из окрашенных рассечений, позволяет рассчитывать межклеточные расстояния. Экспланты также могут быть использованы для обширного пространственного профилирования или массовой цитометрии, что позволяет одновременно профилировать сотни биомаркеров с дополнительным разрешением при сохранении 3D-структуры образца.
ПД могут предсказать эффективность иммунотерапии. Например, можно было бы различать чувствительные или устойчивые случаи к ингибиторам иммунных контрольных точек и исследовать механизмы, лежащие в основе этого различия.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье подробно описывается методика использования эксплантатов, полученных от пациентов (PDE), в качестве доклинической платформы для оценки ответа опухолей человека на лекарственную терапию. Подход с использованием PDE позволяет сохранить трехмерную архитектуру и микроокружение опухоли, что обеспечивает точное прогнозирование исходов для пациентов и способствует поиску биомаркеров чувствительности и резистентности к препаратам.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология рака
- Доклинические испытания лекарственных средств
- Исследования микроокружения опухоли
Теоретические сведения
- Традиционные доклинические модели часто не способны воспроизвести сложность микроокружения опухоли человека и внутриопухолевую гетерогенность.
- Эксплантаты опухолей (PDE) сохраняют патологические и архитектурные особенности исходных опухолей, предоставляя более клинически релевантную модель.
- Было показано, что PDE позволяют различать химиочувствительные и химиорезистентные опухоли, что коррелирует с ответом пациентов на терапию.
- Данная платформа позволяет изучать молекулярные, генетические и гистологические особенности, которые предсказывают ответ на лекарственные препараты.
Цель исследования
- Представить подробный протокол получения, культивирования и анализа эксплантатов опухолей пациентов.
- Продемонстрировать, как эксплантаты опухолей пациентов (PDEs) могут быть использованы для оценки эффективности препаратов и выявления прогностических биомаркеров.
- Осветить применение мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа и мультиспектральной визуализации для пространственного профилирования биомаркеров.
Используемые методы
- Сбор и подготовка свежей ткани опухоли, включая нарезку на мелкие фрагменты.
- Краткосрочное культивирование эксплантатов на органотипических вставках в 3D-контексте.
- Лечение эксплантатов препаратами с использованием соответствующих контролей.
- Фиксация, гистологическая обработка и заливка эксплантатов для анализа.
- Мультиплексное иммунофлуоресцентное окрашивание и мультиспектральная визуализация для пространственного профилирования биомаркеров.
- Анализ изображений, включающий сегментацию тканей и клеток, классификацию фенотипов, а также количественную оценку жизнеспособности и пролиферации клеток.
Основные результаты
- PDE позволяют идентифицировать и фенотипировать отдельные популяции клеток как в опухолевых, так и в стромальных областях.
- После применения препарата возможен количественный анализ гибели и пролиферации клеток.
- Из окрашенных срезов тканей можно извлечь пространственную информацию, например, межклеточные расстояния.
- PDE позволяют дифференцировать чувствительные и резистентные к препаратам образцы опухолей, что было продемонстрировано на примере иммунотерапевтических средств, таких как Nivolumab.
- Платформа поддерживает расширенное пространственное профилирование и масс-цитометрию для многомерного анализа биомаркеров.
Выводы
- PDE (пациент-производные эксплантаты) предоставляют надежную, клинически значимую модель для доклинического тестирования лекарственных препаратов и поиска биомаркеров.
- Данная методология позволяет точно прогнозировать ответы пациентов и способствует разработке персонализированной терапии рака.
- Сочетание 3D-культивирования, мультиплексной визуализации и передовых методов анализа обеспечивает комплексную оценку действия препаратов в микроокружении опухоли.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эксплантаты опухолей, полученные от пациентов (PDE), представляют собой клинически значимую доклиническую платформу, которая сохраняет микроокружение опухоли и ее внутриопухолевую гетерогенность, что напрямую решает основную проблему традиционных моделей. Это позволяет более точно прогнозировать резистентность и чувствительность к препаратам, обеспечивая трансляционную преемственность от этапа поиска молекул до стратификации пациентов. Платформа PDE улучшает процесс принятия решений по портфелю препаратов, генерируя применимые на практике количественные данные об ответе на лекарственные средства и биомаркерах, которые коррелируют с клиническими исходами.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы в контексте опухоли человека.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней за счет сохранения взаимодействий между опухолью и стромой.
- Способствует снижению механистических рисков посредством прямого измерения эффектов препарата на жизнеспособную ткань опухоли.
- Повышает прогностическую уверенность при продвижении мишеней на более поздние стадии разработки.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированную трехмерную (3D) биологическую систему для скрининга соединений в физиологически релевантных условиях.
- Позволяет проводить количественную и воспроизводимую оценку жизнеспособности, пролиферации и гибели клеток после обработки.
- Обеспечивает стандартизацию и масштабируемость анализа для высококонтентной оценки лекарственных препаратов.
- Позволяет проводить мультиплексный анализ биомаркеров для определения приоритетов при скрининге.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет данные о доклиническом ответе на лекарственные препараты с клинико-патологическими параметрами для поиска трансляционных биомаркеров.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении исследований путем прогнозирования специфичной для пациента резистентности или чувствительности к препарату.
- Способствует поиску новых интервенционных стратегий для сенсибилизации резистентных опухолей.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации с использованием релевантных моделей пациента.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
PDE интегрируются в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая связующее звено между скринингом in vitro и клиническим применением, что способствует как идентификации перспективных соединений, так и стратификации пациентов на основе биомаркеров.
- Поисковая биология: поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в сохранном микроокружении опухоли.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для оценки соединений в 3D-контексте.
- Аналитика: позволяет проводить высококонтентные измерения, включая пространственное профилирование и сегментацию клеток, для сравнения эффектов препаратов.
- Трансляционные исследования: сопоставляет данные о ответе на препарат с клиническими параметрами для валидации биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для непрерывных исследований чувствительности и резистентности к препаратам для различных типов опухолей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при оценке ответа на препарат.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы обработки тканей, визуализации и количественного анализа.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет установления связи между доклиническими данными и исходами у пациентов.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию и продвижение кандидатов в препараты с учетом рисков на основе клинически значимых данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с тканями, знания в области гистологии и продвинутого анализа изображений.
- Необходим доступ к инфраструктуре для мультиплексной иммунофлуоресценции и мультиспектральной визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация процессов обработки образцов и интерпретации данных.
- Может потребоваться адаптация метода для различных типов опухолей и индивидуальных условий культивирования.
- Краткосрочное культивирование ограничивает возможность проведения лонгитюдных исследований, но позволяет быстро оценить ответ на лекарственные препараты.
