Сбор и дезагрегирование: упущенный шаг в исследовании методов биопленки

Общая цель этих процедур заключается в сборе и дезагрегировании биопленок оптимальным образом, с тем чтобы повысить воспроизводимость. В этом видео будут продемонстрированы три метода, каждый из которых фокусируется на сборе урожая и дезагрегировании с разных типов поверхностей. Это видео продемонстрирует правильные методы для одного, вихревой и ультразвуковой биопленки с твердой непористой поверхности, такой как поликарбонатный купон из биопленочного реактора CDC.

Во-вторых, соскоб и гомогенизация биопленки с твердой непористой поверхности боросиликатного стекла, обычно встречающейся в реакторе капельного потока. И в-третьих, соскоб, вихрь и обработка ультразвуком биопленки из пористой силиконовой поверхности трубки, обычно встречающейся в модели катетера. Привет, меня зовут Келли Бакингем-Мейер здесь, в Лаборатории стандартизированных методов биопленки.

В нашей лаборатории мы разбиваем методы биопленки на четыре компонента: рост, обработка, отбор проб и анализ. В рецензируемой литературе детали того, как биопленки отбираются или собираются и дезагрегируются с поверхности, как правило, редки. Это причина для этого видео.

Поскольку наша лаборатория разрабатывает и тестирует стандартизированные методы биопленки, мы провели обширный обзор литературы, в котором были определены три наиболее распространенных метода сбора и дезагрегирования биопленки. Этими методами являются вихревая и ультразвуковая биопленка из поликарбонатного купона, соскабливание и гомогенизация биопленки из купона на боросиликатное стекло, а также соскобление, вихрь и обработка ультразвуком биопленки из силиконовых трубок. Хотя методы, написанные на бумаге, являются мощными, мы надеемся, что видео с техническими деталями, представленными моим коллегой Линдси Миллер и мной, будет полезным.

Для начала вырастите зрелую биопленку Pseudomonas aeruginosa 15442 в соответствии со стандартом ASTM E2562, стандартным методом определения количественной оценки биопленки Pseudomonas aeruginosa, выращенной с высоким сдвигом и непрерывным потоком с использованием реактора биопленки CDC. В конце 48-часового периода роста подготовьтесь к обработке и отбору образцов купонов в соответствии со стандартом ASTM E2871, стандартным методом определения эффективности дезинфицирующих средств против биопленки, выращенной в реакторе биопленки CDC с использованием однотрубочного метода. Затем асептически вставьте автоклавные брызговики в стерильные 50-миллилитровые конические трубки с помощью пламенно-стерилизованных щипцов.

Повторить для всех трубок, которые будут получать лечение. Трубки для управления купонами не нуждаются в брызговике. Асептически извлеките стержень из биопленочного реактора CDC и промойте его в 30 миллилитрах стерильной разбавляющей воды.

Это удалит слабо прикрепленные клетки из биопленки. Держите стержень параллельно столешнице над пробоотборниками с брызговиками. Используя стерилизованный пламенным ключом Allen, ослабьте установленные винты, чтобы бросить купон с биопленочным покрытием в трубку.

Повторите для нужного количества купонов. Снимите брызговики и поместите брызговики в отдельный контейнер для стерилизации. Используя пятимиллилитровую серологическую пипетку, медленно пипетку четыре миллилитра обработки или контроля в трубки так, чтобы жидкость стекала по внутренней части стенки трубки.

Аккуратно закрутите дно трубки так, чтобы любые пузырьки воздуха под купоном были смещены. Подождите от 30 до 60 секунд между каждым добавлением. В конце указанного времени контакта пипетка 36 миллилитров нейтрализатора попадает в пробирки в том же порядке, в котором применялась обработка или контроль.

Вихрь каждой трубы на самой высокой настройке в течение 30 плюс-минус пяти секунд и убедитесь, что достигнут полный вихрь. Поместите трубки в трубчатую стойку, подвешенную в дегазированном ультразвуковом аппарате, так, чтобы уровень воды в ванне был равен уровню воды в трубках. Обрабатывайте образцы ультразвуком при 45 килогерцах, 100% мощности и нормальной функции в течение 30 плюс-минус пяти секунд.

Повторите циклы вихря и обработки ультразвуком и закончите последним вихрем, в общей сложности пять циклов. Наконец, последовательно разбавляйте образец, наносите разбавление на агар R2A и инкубируйте пластины в течение 24 часов при 36 градусах Цельсия. Подсчитайте колонии в соответствии с методом покрытия и запишите данные.

Этот следующий метод сбора и дезагрегирования биопленки полезен для твердых непористых купонов, которые являются стандартными в реакторе капельного потока. Вырастите зрелую биопленку Pseudomonas aeruginosa 15442 в соответствии со стандартом ASTM E2647 Стандартный метод определения количественной оценки биопленки Pseudomonas aeruginosa, выращенной с использованием реактора биопленки с капельным потоком с низким сдвигом и непрерывным потоком. Настройте станцию отбора проб, чтобы включить плату для отбора проб, 95% этанола в стакане, спиртовую горелку, гемостаты, инструмент для удаления купонов, стаканы со стерильной разбавленной водой и разбавляющие трубки для промывки купонов.

Выключите насос, снимите крышку канала и используйте стерильный инструмент для удаления купона и гемостаты, чтобы удалить купон, стараясь не потревожить биопленку. Промойте купон, осторожно погружаясь движением жидкости в 45 миллилитров стерильной разбавляющей воды, содержащейся в 50-миллилитровой центрифужной трубке. Немедленно отмените движение, чтобы удалить купон.

Поместите купон в стакан, содержащий 45 миллилитров стерильной разбавляющей воды. Соскребайте покрытую биопленкой поверхность купона в направлении вниз в течение примерно 15 секунд с помощью стерильного шпателя или скребка. Промойте шпатель или скребок, перемешав его в стакане.

Повторите процесс выскабливания и промывки три-четыре раза, обеспечив полное покрытие поверхности купона. Промойте купон, удерживая его под углом 60 градусов над стерильным стаканом и пипетируя один миллилитр стерильной разбавляющей воды над поверхностью купона. Повторите в общей сложности пять полосканий.

Окончательный объем в стакане теперь составляет 50 миллилитров. Работая в шкафу биобезопасности, гомогенизируйте соскобленный образец биопленки. Прикрепите к гомогенизатору стерильный гомогенизатор.

Поместите наконечник зонда в жидкость, включите гомогенизатор и увеличьте до 20 500 оборотов в минуту. Гомогенизируйте образец в течение 30 секунд. Выключите обороты и выключите гомогенизатор.

Дезинфицируйте зонд между образцами биопленки путем гомогенизации в девяти миллилитрах стерильной заготовки для разбавления при 20 500 об/мин в течение 30 секунд, как описано выше. Гомогенизируйте девятимиллилитровую трубку с 70% этанолом в течение 30 секунд, отсоедините зонд и дайте ему постоять в этаноловой трубке в течение одной минуты. Гомогенизируйте две дополнительные заготовки для разбавления.

Кроме того, для каждого образца может использоваться стерильный одноразовый гомогенизаторный зонд. Последовательно разбавляют гомогенизированный образец, наносят разбавления на R2A с использованием соответствующего метода покрытия и инкубируют пластины в течение 24 часов при температуре 36 градусов Цельсия. Подсчитайте колонии и запишите данные.

Этот окончательный метод сбора и дезагрегирования биопленки полезен для биопленки, выращенной в пористых трубках, таких как силиконовые трубки, используемые в модели катетера. Чтобы начать эту процедуру, вырастите зрелую биопленку E.coli 53498 в силиконовой катетерной трубке. Подготовьте образцы материалов: промытые трубки, стерильная центрифужная трубка, пустая стерильная чашка Петри, пламенно-стерилизованные гемостаты из нержавеющей стали, ножницы, таймер и линейка.

Когда насос приостановлен, используйте 70% этанол для очистки внешней стороны трубки. Измерьте два сантиметра от конца, избегая области, прикрепленной к разъему, и отметьте трубку, чтобы определить места резки. Огненно-стерилизованными ножницами вырежьте трубку на двухсантиметровую отметку.

Промойте сегмент трубки, чтобы удалить планктонные ячейки. С помощью стерилизованных щипцов осторожно погрузить сегмент трубки в 20 миллилитров стерильной разбавляющей воды, затем немедленно удалить. Поместите сегмент в 10 миллилитров нейтрализатора.

С помощью стерилизованных пламенными щипцами удерживайте сегмент трубки и соскребайте стерильным деревянным аппликатором до тех пор, пока все внутренние участки трубки не будут соскоблены. Время от времени промывайте палочку в 10 миллилитрах нейтрализатора и поместите сегмент обратно в пробирку. Сегмент скребковых труб теперь составляет 10 к нулю или к нулю разбавления.

Вихрь каждой трубки на самой высокой настройке в течение 30 плюс-минус пять секунд. Поместите трубки в трубчатую стойку, подвешенную в ванне соникатора, так, чтобы уровень воды в ванне был равен уровню жидкости в трубках. Ультразвук при 45 килогерцах, 100% мощности и нормальной функции в течение 30 плюс-минус пять секунд.

Повторите этот цикл вихря и обработки ультразвуком, затем закончите с последним вихрем. Последовательно разбавляйте образцы в буферной воде. Нанесите на триптический соевый агар с помощью соответствующего метода нанесения покрытия и затем инкубируйте трубки при 36 плюс-минус двух градусах Цельсия в течение 24 часов.

Подсчитайте колонии в соответствии с используемым методом покрытия и запишите данные для вычисления среднего арифметического. Эти четыре снимка, сделанные Даниэль Ор и Блейном Фрицем, помогают проиллюстрировать важность этой процедуры сбора урожая и дезагрегирования. Все эти четыре купона были окрашены кристаллическим фиолетовым цветом, чтобы помочь визуализировать количество биопленки Pseudomonas aeruginosa, присутствующей на купонах до и после процесса вихря и обработки ультразвуком.

Купон A полностью покрыт биопленкой, в то время как купоны B, C и D имеют значительно меньше биопленки на своей поверхности. Купоны B, C и D были подвергнуты описанному ранее процессу вихря и обработки ультразвуком. Эти два снимка, сделанные Линдси Миллер на конфокальном микроскопе с увеличением 12,5X, изображают биопленку Pseudomonas aeruginosa, которая была обработана живым / мертвым пятном заднего света.

Изображение слева было обработано ультразвуком при 45 килогерцах и 10% мощности, в то время как изображение справа было обработано ультразвуком при 45 килогерцах и 100% мощности. Очевидно, что купон слева имеет гораздо больше биопленки, оставшейся на его поверхности по сравнению с купоном справа. Этот последний рисунок показывает, как манипуляции с различными параметрами обработки ультразвуком влияют на количество биопленки Pseudomonas aeruginosa, удаленной с поверхности купона.

Все эти купоны были обработаны ультразвуком при 45 килогерцах, 100% мощности и при нормальной настройке в течение 30 плюс-минус пять секунд. Эти снимки были сделаны с 12,5-кратным увеличением Линдси Миллер. Купоны в первом ряду были обработаны ультразвуком в разбавленной воде, в то время как купоны во втором ряду были обработаны ультразвуком в нейтрализующем бульоне DE.

Похоже, что на купонах, которые были обработаны ультразвуком в бульоне DE, который содержит поверхностно-активное вещество, остается меньше биопленки по сравнению с разбавленной водой. Купоны A, B, E и F были обработаны ультразвуком в объеме 10 миллилитров, в то время как купоны C, D, G и H были обработаны ультразвуком в 40 миллилитрах раствора. На купонах, которые были обработаны ультразвуком, явно меньше биопленки в меньших объемах.

Купоны A, C, E и G обрабатывались ультразвуком в ванне сразу тремя трубками, в то время как купоны B, D, F и H обрабатывались ультразвуком в ванне с 12 трубками одновременно. Похоже, что образцы, обработанные ультразвуком с меньшим количеством трубок, продемонстрировали превосходный сбор биопленки. В конечном счете, минимизация объема в пробирках, уменьшение количества пробирок, обработанных ультразвуком одновременно, и использование нейтрализующего de бульона, по-видимому, способствуют улучшению сбора биопленки.

Не существует идеального метода сбора и дезагрегирования биопленки, но некоторые подходы лучше для разных поверхностей и / или применений. Методы, продемонстрированные в этом видео, являются тремя наиболее распространенными методами в соответствии с обзором литературы. Эти три метода могут стать отправной точкой для исследователей.

Важно потратить время на проверку выбранного метода сбора и дезагрегирования. Все оборудование немного отличается, поэтому, даже если метод был стандартизирован, все равно разумно подтвердить процесс для используемого оборудования. Исследования показали, что неправильный выбор может привести к предвзятым результатам испытаний.

После просмотра этого видео эта информация, как мы надеемся, поможет исследователям принять более обоснованные решения о том, какой метод использовать, и предоставит рекомендации по улучшению воспроизводимости для трех типов поверхностей и дополнительных методов сбора и дезагрегирования.