Ex Vivo Высвобождение пептида, связанного с геном кальцитонина, из тригеминосаскулярной системы у грызунов

Настоящий протокол описывает модель высвобождения ex vivo кальцитонина, связанного с геном пептида (CGRP), и стратегию количественной оценки влияния фармакологических агентов на количество CGRP, высвобождаемого из тригеминозускулярной системы у грызунов.

Этот метод является инструментом для исследования механизмов, участвующих в высвобождении CGRP из тройничной сосудистой системы. Основным преимуществом этого метода является возможность разделить тройничную сосудистую систему на три разных участка и оценить высвобождение CGRP в пределах каждого отдельного участка. Демонстрировать процедуру буду я и Ингер Янсен-Олесен, старший научный сотрудник нашей группы.

Для начала подготовьте ткань крысы, удалив кожу и мышцы вокруг головы и шеи с помощью ножниц. Затем используйте костный триммер и ножницы, чтобы отделить нижние челюсти от головы. Теперь обнажите спинной мозг и ствол головного мозга, вставив костный триммер каудально в дорсальную часть позвонков и удалите его.

Затем разрезают каудальную часть черепа по границам затылочной и межтеменной костей, чтобы удалить эти костные структуры, обнажив мозжечок. Чтобы изолировать ТНК, проходящую каудально примерно на 13-16 миллиметров от брегмы с каждой стороны, отрежьте дорсолатеральную часть ствола мозга пружинными ножницами. За этим следует погружение левой и правой стороны ТНК в SIF.

Далее разрезаем головку посередине, чтобы разделить череп на две части с помощью пилы. Теперь аккуратно удалите мозг, не касаясь твердой мозговой оболочки, прикрепленной к черепу с помощью шпателя. Чтобы изолировать ТГ, срежьте его, включая ветви вокруг визуальных границ с нижнечелюстной ветвью, входящей в овальное отверстие, и офтальмологическими и верхнечелюстными ветвями, входящими в череп.

Затем погрузите половинки черепа и ТГ в SIF. Чтобы подготовить ткани мыши, удалите кожу и мышцы вокруг головы и шеи с помощью ножниц. Теперь обнажите спинной и головной мозг, вставив ножницы каудально в дорсальную часть позвонков и удалите ее.

Затем разрезают каудальную часть черепа по границам затылочной и межтеменной костей, чтобы удалить эти костные структуры, обнажающие мозжечок. Отрежьте теменную кость в середине и удалите кость, чтобы обнажить головной мозг. Осторожно удалите мозжечок, чтобы обнажить ствол мозга с помощью шпателя.

Изолируйте TNC, содержащую часть ствола мозга, пружинными ножницами с последующим погружением ствола мозга в SIF. Теперь аккуратно удалите мозг с помощью шпателя и перережьте тройничный нерв, где он входит в ствол мозга. Чтобы изолировать ТГ, срежьте его, включая его ветви вокруг визуальных границ с нижнечелюстной ветвью, где она входит в овальное отверстие и офтальмологические и верхнечелюстные ветви, входящие в череп.

Затем погрузите TGs в SIF. Для удобства замены SIF добавьте в пластиковые контейнеры платную крышку и начните мыть ткань крысы и мыши в SIF в течение 30 минут, заменяя SIF каждые пять минут. После 30 минут мытья при комнатной температуре перенесите половинки ТНК крыс и крысиные ТГ в отдельные колпачки микроцентрифуги с 350 микролитрами SIF.

Перенесите ствол мозга мыши с TNC в колпачок микроцентрифуги с 250 микролитрами SIF. Наконец, перенесите две мышиные ТГ в колпачок микроцентрифуги с 250 микролитрами SIF. Поместите половинки черепа крысы на шестилуночную культуральную пластину и заполните череп 400 микролитрами SIF.

Поместите черепа крыс в колпачки микроцентрифуги с тканью крысы и мыши в увлажненный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия. Заменяйте SIF с помощью пипетки каждые пять минут в течение 20 минут, не касаясь ткани. Подготовьте микроцентрифужные пробирки для отбора проб путем соответствующей маркировки.

Затем добавьте 50 микролитров 10-прочного буфера EIA к каждой микроцентрифужной трубке. Далее готовят испытуемый раствор соединения и раствор транспортного средства путем разбавления в SIF для всех концентраций. После последней промывки добавьте 250 микролитров SIF к ТГ и ТНК мыши, 350 микролитров SIF к ТГ и ТНК крыс и 400 микролитров SIF к каждому черепу крысы.

После 10 минут инкубации соберите 200 микролитров образца в предварительно меченую микроцентрифужную трубку с 50 микролитрами 10-прочного буфера EIA, чтобы можно было измерить базальное высвобождение CGRP. Выбрасываем оставшуюся жидкость и сразу же храним образцы при минус 20 градусах Цельсия. Добавляют испытуемое соединение в соответствующее транспортное средство в возрастающих концентрациях, начиная с самой низкой концентрации, и инкубируют в течение 10 минут.

После 10 минут инкубации соберите 200 микролитров образца в предварительно маркированную микроцентрифужную трубку с 50 микролитрами 10-прочного буфера EIA. Отбросьте оставшуюся жидкость и добавьте вторую самую низкую концентрацию в ткань. Немедленно храните образцы при минус 20 градусах Цельсия и повторяйте эту процедуру с оставшейся концентрацией.

Чтобы выполнить положительный контроль для эксперимента, добавьте положительный контроль к ткани в конце протокола. После инкубационного периода в 10 минут соберите образец мощностью 200 микролитров в микроцентрифужную трубку с 50 микролитрами 10-сильного буфера EIA. Концентрации CGRP, высвобождаемые в собранных образцах, измеряются с помощью комплекта для ОВОС в соответствии с инструкциями завода-изготовителя, прилагаемыми к комплекту для ОВОС.

У крыс воздействие капсаицина индуцировало значительное высвобождение CGRP из твердой мозговой оболочки и ТГ по сравнению с транспортным средством. В твердой мозговой оболочке максимальное высвобождение CGRP было обнаружено на одном микромоляре капсаицина. А при ТГ максимальное высвобождение CGRP было обнаружено при 10 микромолярах капсаицина.

При анализе с односторонним ANOVA глибенкламид не оказывает влияния на высвобождение базальной CGRP из твердой мозговой оболочки и ТГ. Глибенкламид значительно снижал высвобождение CGRP, индуцированное капсаицином, в твердой мозговой оболочке на 40% и TG на 39% по сравнению с капсаицином с транспортным средством при анализе с односторонним ANOVA. Было обнаружено, что переходный рецепторный потенциал анкирин-1 суперкоринамальдегид высвобождает CGRP в зависимости от концентрации из TG с 1, 10 и 100 микромоляром суперкоринамальдегида, что приводит к увеличению высвобождения CGRP на 9% 52% и 69% по сравнению с транспортным средством соответственно при анализе с двусторонней ANOVA. Повышенное высвобождение CGRP отсутствовало в ТГ у нокаутирующих мышей с переходным рецепторным потенциалом Ankyrin-1, где воздействие 1, 10 и 100 микромоляра суперкоринамальдегида приводило к изменению высвобождения CGRP на 11% минус 13% и 9% по сравнению с транспортным средством соответственно при анализе с двусторонней ANOVA.

Важно быть осторожным, чтобы не касаться ткани во время отбора образцов и быть точным при определении времени инкубации для всех образцов. При наличии адекватных наборов ИФА можно применить эту процедуру для измерения высвобождения других пептидов, присутствующих в тройничной сосудистой системе.