Получение замороженных островков плода плода примата для комбинированного одноядерного РНК-секвенирования и ATAC-секвенирования, а также объемной метаболомики
8 ноября 2024 г.
В этом протоколе описаны процедуры выделения высококачественных ядер из замороженных островков поджелудочной железы приматов, не являющихся человеком, для использования в одновременном секвенировании одноядерных РНК и секвенировании ATAC с сохранением объемной цитозольной фракции для метаболомных анализов из тех же образцов.
Мы используем высокотрансляционную, нечеловеческую модель приматов для оценки того, как рацион матери и потребление лекарств во время беременности влияют на эмбриональное развитие и постнатальную функцию островков поджелудочной железы у потомства. Запрограммированные в развитии изменения могут изменить восприимчивость к болезням в более позднем возрасте. Сложность при работе с труднодоступными образцами, такими как образцы приматов, заключается в эффективной оценке нескольких вопросов от одной и той же особи.
К сожалению, одновременное извлечение информации из метаболома и генома может быть затруднено из-за несовместимости реагентов анализа при чувствительной ко времени деградации молекул, подлежащих количественному определению. Наш протокол позволяет экстраполировать распространенность метаболитов, доступность хроматина и дифференциальную экспрессию генов из одного и того же исходного материала. Этот многоуровневый подход дает представление о том, как метаболизм может изменить геном в островках поджелудочной железы.
Обзор
В данном протоколе описаны методы выделения высококачественных ядер из замороженных панкреатических островков нечеловекообразных приматов для одновременного проведения секвенирования РНК и секвенирования ATAC. Также сохраняется общая цитозольная фракция для метаболомного анализа, что позволяет комплексно изучить метаболические и геномные взаимодействия.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология
- Метаболомика
Теоретические сведения
- Модели на приматах имеют решающее значение для изучения механизмов заболеваний человека.
- Рацион питания и прием лекарственных средств матерью могут влиять на развитие островков поджелудочной железы у потомства.
- Одновременный анализ метаболома и генома затруднен из-за деградации образцов.
- Данное исследование направлено на решение проблемы необходимости проведения эффективного многоуровневого анализа ограниченного количества образцов.
Цель исследования
- Оценить влияние материнских факторов на развитие островков эндокринной ткани поджелудочной железы эмбриона.
- Изучить, как метаболические изменения могут влиять на геномную экспрессию.
- Разработать протокол, позволяющий проводить комплексный анализ одного и того же образца.
Используемые методы
- Выделение ядер из островков поджелудочной железы.
- Одновременное секвенирование РНК и секвенирование ATAC.
- Сохранение цитозольных фракций для метаболомных исследований.
- Многоуровневый анализ для оценки содержания метаболитов и экспрессии генов.
Основные результаты
- Успешное выделение высококачественных ядер и цитозольных фракций.
- Представление о том, как рацион питания матери влияет на функцию островков поджелудочной железы.
- Продемонстрированная возможность одновременного проведения геномного и метаболомного анализов.
- Выявление потенциальных связей между метаболизмом и экспрессией генов в островках.
Выводы
- Данный протокол позволяет проводить комплексный анализ островков Лангерганса поджелудочной железы.
- Полученные результаты могут быть использованы в будущих исследованиях предрасположенности к заболеваниям.
- Подчеркивается значимость влияния материнского организма на здоровье потомства.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Интеграция методов секвенирования РНК единичных ядер (snRNA-seq), ATAC-seq и общего метаболомного анализа островков из замороженных тканей приматов позволяет устранить критический барьер в мультиомиксных исследованиях при использовании редких или ценных образцов. Данный подход обеспечивает комплексное молекулярное профилирование ограниченного количества материала, что повышает прогностическую достоверность при ранней валидации мишеней и механистическом снижении рисков. Описанный протокол максимально увеличивает выход данных из каждого образца, что позволяет принимать обоснованные решения по формированию портфеля исследований в области метаболических заболеваний и нарушений развития.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать метаболические и эпигенетические механизмы, лежащие в основе клеточной идентичности в системах, имеющих значение для патологии.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем установления связи между содержанием метаболитов, экспрессией генов и доступностью хроматина.
- Способствует снижению механистических рисков за счет интеграции многоуровневых молекулярных данных, полученных из одного биологического источника.
Скрининг и разработка анализа
- Готовит валидированные ядерные и цитозольные фракции для последующего высокопроизводительного секвенирования и метаболомного анализа.
- Повышает воспроизводимость и стандартизацию анализа за счет минимизации пакетных эффектов в исследованиях с участием нескольких когорт.
- Обеспечивает количественные мультиомные результаты для надежной оценки воздействия соединений или пертурбаций.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет молекулярные показатели с метаболическими и эпигенетическими биомаркерами, имеющими значение для заболевания в трансляционных моделях.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации за счет использования моделей на приматах.
- Предоставляет прогностические данные о механизмах развития программирования и предрасположенности к заболеваниям.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный протокол связывает этапы раннего поиска, валидации мишеней и трансляционных исследований, обеспечивая возможность мультиомиксного профилирования редких образцов тканей.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о метаболических и эпигенетических взаимодействиях при развитии островков.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые препараты ядер и метаболитов для масштабируемого омиксного анализа.
- Аналитика: Предоставляет количественные данные об экспрессии генов, доступности хроматина и содержании метаболитов для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Связывает молекулярные результаты с фенотипами, имеющими значение для заболеваний, на моделях приматов.
- Практическое применение: Формирует воспроизводимый рабочий процесс для максимального извлечения данных из ограниченных или архивных образцов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и уменьшает механистическую неопределенность на ранних этапах исследований.
- Операционная ценность: стандартизирует подготовку мультиомных образцов и минимизирует эффекты батча.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) и эффективно использовать редкие образцы.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации программ по изучению метаболических и developmental заболеваний с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения ядер, секвенирования одиночных ядер и метаболомных исследований.
- Необходим доступ к инфраструктуре высокопроизводительного секвенирования и масс-спектрометрии.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для контроля эффектов серии (batch effects).
- Метод может быть адаптирован для других типов тканей, однако может потребоваться оптимизация протокола для различных матриц образцов.
- Ограниченное количество образцов и их чувствительность к деградации накладывают практические ограничения на пропускную способность и сроки проведения работ.
