Получение встроенной в агаровую бусину Mycobacterium abscessus для инокуляции иммунокомпетентных мышей внутритрахеально

Мы разрабатываем мышиную модель хронической инфекции легких mycobacterium abscesss для проверки эффективности антибиотиков в доклинических исследованиях. Первая задача состоит в том, чтобы преодолеть внутреннюю устойчивость мышей к абсцессам микобактерий. Вторая задача заключается в том, чтобы создать воспроизводимую партию агаровых бактерий, способных взбить внедренные бактерии для внутритрахеальной инфекции. Мы хотим поделиться подробным протоколом подготовки агарового удара и заражения, который может быть легко реализован другими лабораториями для тестирования новых лекарств на мышах.

Заражение агаром бьет внедренные бактерии вместо свободных бактерий, частично преодолевает способность иммунокомпетентных мышей к спонтанному избавлению от инфекции. Эта модель обеспечивает надежный доклинический инструмент для оценки новых антибиотиков против Mycobacterium abscessus, способствуя открытию и разработке столь необходимых антибиотиков против легочных инфекций.

[Инструктор] Для начала необходимо получить экспоненциально растущие суспензионные культуры микобактерий абсцессуса, отрегулированные до оптической плотности 30. Перелейте 27 миллилитров расплавленного соевого шнека, предварительно уравновешенного при температуре 50 градусов Цельсия, в пробирку, содержащую три миллилитра бактериальной суспензии. Перемешайте суспензию с помощью пипетирования. Тщательно пипеткой измельчите бактериальную смесь в колбу, содержащую в колбе 60 миллилитров минерального масла. Поместите колбу во вторичную емкость и сразу же начните перемешивать на средней скорости с помощью магнитной мешалки с помощью магнитной мешалки. Убедитесь, что в смеси масляного шнека образуется видимый вихрь, и продолжайте помешивать в течение шести минут при комнатной температуре. Поместите лед во вторичную емкость, чтобы суспензия остыла. Затем переложите суспензию в центрифужные пробирки объемом 250 миллилитров. Центрифугируйте суспензию при 3700 G в течение шести минут при четырех градусах Цельсия в течение первых пяти циклов и повторно суспендируйте гранулу шнекового борта с помощью DPBS. Кроме того, соберите сетчатый фильтр для ячеек воронки, соединительное кольцо и трубку объемом 50 миллилитров в единое целое. После 10-й стирки повторно суспензируйте гранулу и разведите суспензию шариков в четыре раза. Добавьте разведенный материал образца на ситечко, чтобы отфильтровать суспензию гранул. Медленно потяните за поршень 30-миллилитрового шприца, прикрепленного к соединительному кольцу, чтобы создать всасывание и усилить фильтрацию. Затем центрифугируйте разведенную суспензию при 1000 G в течение двух минут для ее концентрации. После того, как вы вытащите гранулы в 50-миллилитровую трубку, храните их при температуре четыре градуса Цельсия до одной недели, но готовьте свежие бусины для каждой партии экспериментов. Для начала ограничьте мышей CD One с помощью специально разработанной трехмерной подставки с печатью и наклоном. Закрепите мышь за резцы с помощью шовной нити, прикрепленной к центральному стержню подставки. Положение мыши в брюшной лежачей позе с поднятой головой. Прикрепите металлическую иглу для кормления животных 24 калибра к стеклянному шприцу, наполненному суспензией шнековых бусин Mycobacterium abscessus. Поместите нейлоновые зажимы или пробки на поршень, чтобы обеспечить контролируемый объем инокулята 50 микролитров на одну мышь. Теперь расположите металлическую иглу для зонда вертикально над мышью. Осторожно введите иглу вверху и проведите ее дальше вниз в трахею. Снимите нейлоновый зажим или пробку и медленно введите в легкие 50 микролитров суспензии шнековых бусин Mycobacterium abscessus. Дайте мышке отдохнуть в течение пяти минут. Затем повторите процедуру инокуляции во второй раз, чтобы обеспечить глубокое и воспроизводимое осаждение полного инокулюма в легкие. Шнековые бусины, содержащие Mycobacterium abscessus, экспрессировали красный флуоресцентный белок mCherry и варьировались по размеру от примерно 70 до 250 микрометров. Бактериальная нагрузка на шесть независимых препаратов гранул показала высокую воспроизводимость. Бактериальный подсчет до и после прохождения через стеклянный шприц не показал существенной потери бактериальной нагрузки. Метод межтрахеального инокуляции был воспроизведен на трех независимых препаратах гранул, о чем свидетельствует подсчет КОЕ в легких через 24 часа после заражения. Воспроизводимость инфекции между тремя независимыми операторами была подтверждена, поскольку количество КОЕ в легких через 24 часа после заражения оставалось неизменным во всех группах.