Оптимизированный метод культивирования и микробной биоаугментации Typha latifolia (рогоз)

Наша работа касается отсутствия протоколов по выращиванию камыша из семян. Мы разработали воспроизводимые методы прорастания семян, раннего роста и микробной биоаугментации для поддержки будущих исследований в области растительных микробов. Немногие исследования выращивают камыша из семян или отслеживают его до зрелости, однако рогоз широко используется в исследованиях по очистке водно-болотных угодий.

Большинство исследований рояника связаны с приобретением корневищ для размножения камыша в лабораторных исследованиях. Немногие исследования выращивают камыш из семян, не оставляя стандартизированных методов. Достижение стабильного прорастания и постоянной колонизации интродуцированных микробов стало серьёзной задачей.

Мы разработали воспроизводимые методы прорастания семян и микробной биоаугментации, демонстрируя, как ранняя инокуляция помогает поддерживать долгосрочную колонизацию. Для начала используйте садовые ножницы, чтобы обрезать стебель растения Typha latifolia примерно в двух сантиметрах от основания соцветия. Снимите семена с соцветия, переместите их в лабораторный блендер, пока блендер не заполнится примерно на четверть, что соответствует примерно 250 миллилитрам неуплотнённых семян.

Теперь наполните блендер 500 миллилитрами водопроводной воды, чтобы сохранить 10 сантиметров над головой. Взбивайте смесь на средней низкой скорости в течение 20 секунд и сразу перелейте вязкое содержимое в термостакан на один литр. Переливайте примерно 100 миллилитров смеси из семенной обратно в блендер.

Затем добавьте от 400 до 600 миллилитров свежей водопроводной воды и взбивайте на средней высокой скорости в течение 20 секунд. Вылейте содержимое в свежий стакан на один литр. Теперь наполните стакан водопроводной водой до 800 миллилитров.

После 60 секунд зачерпните плавающий шлам сверху, не трогая семена, осевшиеся внизу. Медленно вылейте оставшуюся воду и переложите семена в стакан на 100 миллилитров. Повторите процесс смешивания оставшегося осадка из семянной воды. Далее положите стакан с разделёнными семенами на тарелку для перемешивания.

После перемешивания уберите любую плавающую растительную материю с поверхности стакана. Высыпите семена в воронку Buchner с фильтрующей бумагой, прикреплённой к пылесосу, и дайте им высохнуть на ночь. Храните сушёные семена при 20 градусах Цельсия в конических полипропиленовых трубках объёмом 50 миллилитров.

Подготовьте медиапластины Murashige и Skoog полусилы с 1% фито-агаром. Переложите примерно один миллиграмм сушёных семян в 15-миллилитровую коническую полипропиленовую трубку. Затем добавьте в пробирку 10 миллилитров стерильной двойной дистиллированной воды.

Поставьте трубку на орбитальный шейкер на средней высокой скорости на 10 минут. Теперь вынимите воду из трубки и добавьте пять миллилитров раствора 0,1% полисорбата 20, приготовленного в стерильной двойной дистиллированной воде. Встряхните трубку на средней высокой скорости в течение 10 минут.

Удалите раствор полисорбата 20. Выполняйте все дальнейшие шаги перед пламенем или ламинарным проточным капюшоном. Замените раствор пятью миллилитрами коммерческого отбеливателя 30% и раствором 0,025% полисорбата 20, приготовленных в стерильной двойной дистиллированной воде.

Замените супернатант стерильной двойной дистиллированной водой. Затем встряхните трубку на средней высокой скорости в течение пяти минут. После третьего промывания вращайте трубку на низкой скорости в течение 24 часов, чтобы вызвать прорастание.

На следующий день удалите лишнюю воду и убедитесь, что в пробирке осталось три миллилитра жидкости. Теперь асептически отрежьте кончик пластиковой пипетки объемом 1000 микролитров. Используйте наконечник пипетки для энергичного пипетирования и подвески семян внутри кончика.

Выложите семена и жидкость на тарелки Murashige и Skoog agar с половинной силой. Аккуратно покрутите тарелку, чтобы равномерно распределить семена. Оберните пластины лабораторной герметичной пленкой, затем поместите их в камеру для роста с 16-часовым световым и 8-часовым тёмным циклом при 23 градусах Цельсия и влажности 70%.

Для инокуляции семян камыша стерилизуйте семена полисорбата 20 и двойной дистиллированной водой, как показано. Измерьте оптическую плотность ночной культуры изолята Luteimonas на 600 нанометров. Нормализуйте культуру до значения поглощения 1.0, разбавляя в культурной среде.

Теперь центрифугуйте один миллилитр культуры при 9 300 г в течение двух минут. Удалите супернатант и снова суспензируйте гранулу в одном миллилитре PBS. После центрифугирования и повторного удаления супернатанта суспензируйте бактериальную гранулу в одном миллилитре стерильной двойной дистиллированной воды.

Используйте стерилизованные семена, затем разведите инокулум в разведении от 1 до 10 с добавлением 0,025% органосиликонового поверхностно-активного вещества в той же трубке. Встряхивайте подвеску на низкой скорости в течение 24 часов до прорастания семян. Начните с заполнения стерильной камеры роста растений выбранной почвой, предварительно увлажненной водопроводной водой.

Накройте кончик Luer Lock алюминиевой фольгой и уведите устройство в жидкий цикл на 20 минут. Далее, в стерильных условиях, к разъёму блока Luer в камере роста подключается фильтр диаметром 0,2 микрометра. Откройте камеру и добавьте в почву 500 микролитров фильтра, стерилизованного 1% на 20 на 20 на 20.

Смешайте почву стерильной лопаткой и одновременно добавляйте стерильную двойную дистиллированную воду, чтобы поддерживать гидратацию без перенасыщения почвы. Теперь используйте стерильное лезвие бритвы, чтобы разрезать агар Мурашиге и Скуга с тарелок с одной слабой старой сеянцей, на четверти. Стерильной лопаткой перенесите один участок агара с саженцами на подготовленную почву в камере роста.

Перенесите камеру роста в инкубатор растений с 16-часовым светом и 8-часовым тёмным циклом при 23 градусах Цельсия и влажности 70%. Полная шрамификация семян тифы привела к явному разделению компонентов семян, тогда как неполная рубица оставляла клюв прикреплённым, а нескарфицированные семена оставались целыми. Стерильная гидропонная система доказала свою поддержку роста видов рогоз и Juncus, изображенных здесь как Juncus, которые поддерживались в стерильной системе до одного года.

Самая высокая скорость прорастания семян — 20,8% — была зафиксирована при использовании метода 30% отбеливателя и полисорбата 20, что значительно выше, чем у всех других методов стерилизации, за исключением 1-часового метода с хлорным газом, который не смог полностью стерилизовать семян. Через семь дней после рубцовства прорастающие саженцы Typha развили видимые радикалы и ткань побегов в нестерильной среде плиты Петри. После пересадки в почву часть саженцев Typha успешно укоренилась и за одну-две недели образовала новую ткань побегов.

После инокуляции видами Luteimonas, несущими плазмиду DsRed, колонизация красных флуоресцентных бактерий была зафиксирована по всему корню саженцев Typha через 16 дней после инокуляции.