Система гидропонной совместной культивации для одновременного и систематического анализа молекулярных взаимодействий растений и микробов и сигнализации

Описанная гидропонная система кокультивации поддерживает интактные растения с металлическими сетчатыми экранами и кокультивирует их бактериями. Растительные ткани, бактерии и секретируемые молекулы затем могут быть отдельно собраны для последующих анализов, одновременно позволяя исследовать молекулярные реакции как хозяев растений, так и взаимодействующих микробов или микробиомов.

Общая цель этой системы состоит в том, чтобы изучить взаимное сигнальное взаимодействие и реакции между растениями и микропартнерами или реакцию растений на химические вещества или абиотические факторы в простой экспериментальной установке, которая точно имитирует природную среду. В этом видео показано совместное выращивание растений с бактерией Agrobacterium tumefaciens. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о микробных взаимодействиях растений, реакции микробов или растений на стресс, а также о молекулярной сигнализации, включая сложную передачу сигналов даже на начальной стадии микробных взаимодействий растений.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он помогает понять природу сигналов и реакцию на микробные взаимодействия растений в простой конфигурации, которая включает в себя имитацию естественной среды. Хотя этот метод может быть использован для получения представления о взаимодействии растений с одним видом микробов, он также может быть использован для изучения взаимодействия растений с несколькими видами микробов или с абиотическими факторами. Идея этого метода возникла у нас во время поиска клеточного сигнального гомеостаза во время взаимодействия микробов растений, которые точно имитируют природные ситуации.

Чтобы начать эксперимент, семена необходимо простерилизовать. Для Arabidopsis thaliana смешайте примерно 200 семян с 500 микролитрами деионизированной воды в микроцентрифужной пробирке и закрутите пробирку с высокой скоростью. Центрифугируйте пробирку при давлении 9000 x g в течение 30 секунд в настольной микроцентрифуге.

С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость из воды. Далее добавьте к семенам 300 микролитров 2%-ного гипохлорита натрия и сделайте их вихревыми. Дайте смеси отстояться при комнатной температуре.

Через минуту центрифугируйте семена. С помощью пипетки удалите раствор гипохлорита натрия. Затем добавьте к семенам 500 микролитров стерильной, деионизированной воды, и перемешайте смесь.

После центрифугирования пробирки удалите воду. Добавьте к семенам 500 микролитров 70%-ного этанола, и перемешайте смесь. Дав семенам отстояться в течение одной минуты, центрифугируйте пробирку.

Удалите 70%-ный этанол с помощью пипетки. Пять раз промойте семена 500 микролитрами стерильной, деионизированной воды. Затем повторно суспендируйте стерилизованные семена в 500 микролитрах стерильной, сверхчистой воды.

В каждую стерильную глубокую чашку Петри налейте по 25 миллилитров половинной концентрации Мурасиге и Скуга, или MS среды с 04% фитоагара. Для каждой чашки Петри вырежьте квадрат из нержавеющей стали размером 90 на 90 миллиметров. Загните углы каждой квадратной сетки ровно настолько, чтобы сетка поместилась внутри пластины Петри.

Согните углы под углом 90 градусов к основной массе сетки, чтобы сетка могла подпираться углами, оставляя достаточно места внизу для развития корней. Выложите вырезанные квадраты сетки в мензурку и накройте их алюминиевой фольгой. Простерилизуйте квадраты сетки путем автоклавирования с использованием 30-минутного цикла сушки.

Как только среда затвердеет в чашках Петри и сетка станет стерильной, поместите каждый квадрат сетки поверх твердой среды загнутыми углами вниз. Надавите на сетку так, чтобы углы проникали в среду и основная масса сетки касалась верхней поверхности среды. Затем с помощью стерильной пипетки объемом 200 микролитров вытяните отдельные стерилизованные поверхность семена A thaliana и аккуратно переложите каждое семя поверх сетки.

Разместите семена так, чтобы они были расположены на расстоянии друг от друга в соответствии с видом растения и экспериментальными потребностями. Запечатайте чашки Петри крышками и наклейте пористый хирургический скотч по краям пластин. Заверните семена в алюминиевую фольгу.

Стратифицировать семена, поместив всю чашку Петри. Через два дня культивируйте семена в чашке Петри при температуре от 22 до 24 градусов Цельсия с 16-часовым периодом фотосъемки в течение 10-14 дней. В стерилизованный проточный колпак налить 18 миллилитров автоклавной жидкой среды МС в стерильные цилиндрические стеклянные баки со стерильными крышками.

Затем с помощью стерильных щипцов аккуратно перенесите каждый квадрат сетки с рассадой в возрасте от 10 до 14 дней из чашки Петри полутвердой среды в гидропонный цилиндрический резервуар. Показанная здесь рассада – люцерна. Запечатайте крышки баков с помощью пористой хирургической ленты.

Затем культивируйте рассаду при температуре от 22 до 24 градусов Цельсия с 16-часовым периодом фотосъемки и встряхиванием при 50 оборотах в минуту. Перед прививкой внимательно осмотрите емкость с рассадой на предмет возможного загрязнения. Среда в незагрязненных резервуарах должна быть прозрачной и прозрачной.

Если баки мутные от загрязнения, выбросьте их и пронумеруйте остальные баки. Возьмите по 20 микролитров гидропонной среды из каждого пронумерованного аквариума и положите ее на чашку Петри с бульоном Лурия или агаром LB. Выдерживайте блюдо при температуре 28 градусов Цельсия в течение 28 часов.

Немедленно закиньте в каждый пронумерованный гидропонный бак 50 микролитров суспензии агробактерии tumefacians в каждый пронумерованный гидропонный бак. Совместно культивируйте рассаду и бактерию A tumefacians при температуре от 22 до 24 градусов Цельсия с 16-часовым периодом фотосъемки и встряхиванием при 50 оборотах в минуту. Осмотрите пятнистую пластину LB после 12 и 28 часов инкубации, чтобы убедиться в стерильности гидропонной питательной среды.

При наличии каких-либо загрязнений не используйте соответствующий пронумерованный резервуар, зараженный бактериями, для дальнейших последующих анализов. Далее отделите корни от бактериальной суспензии, приподняв сетчатую пластину. Если вы используете корни для последующих анализов, разрежьте корни, быстро промойте их в воде двойной дистилляции и просушите на стерилизованной фильтровальной бумаге.

Если вы используете листовую или другую ткань, отрежьте ткань. Для анализа транскриптов растений корни или побеги следует немедленно отсадить в жидкий азот. Для анализа бактериального транскрипта перенесите 1,5 миллилитра культуры из бака для совместного культивирования и гранулируйте клетки центрифугированием.

После соответствующего совместного культивирования с помощью стерильных ножниц отделите отдельные вторичные корни, боковые ветви главного корня. Далее промойте корни в двойной дистиллированной воде, чтобы удалить слабо связанный материал. Погрузите каждый корень в 30 микролитров воды на предметное стекло микроскопа, и накройте его стеклянной крышкой.

Края покровного стекла заклейте лаком для ногтей, чтобы защитить корни от обезвоживания. Затем визуализируйте прикрепление A. tumefacians к корням A. thaliana с помощью флуоресцентной микроскопии. После соответствующего совместного выращивания отделите растения от гидропонной среды.

Простерилизуйте 18 миллилитров гидропонной среды, пропустив ее через фильтр с порами 0,2 микрона в конические пробирки объемом 50 миллилитров. Заморозьте образцы при температуре 80 градусов Цельсия на ночь. На следующий день ослабьте крышки на 50-миллилитровых конических тубах и поместите их в сублимационную сушилку на 36 часов.

Наконец, перейдите к хранению или обработке образцов для анализа ВЭЖХ и обнаружения соединений. Не получая искусственно питательных веществ, A tumefacians c58 рос в системе совместного выращивания. Напротив, в контрольной культуре без A. thaliana практически не наблюдался бактериального роста.

Гидропонные системы совместного культивирования могут быть использованы для изучения прикрепления бактерий к структуре корня, как видно на этой микроскопической визуализации, где бактерии, меченные красной флуоресценцией PCherry, были локализованы в структуре корня растения с типичной камнеобразной или нитевидной формой. Профили экспрессии генов как растительных постов, так и взаимодействующих микробов могут быть установлены с помощью QRTPCR. После восьми часов совместного культивирования в восьми клетках tumefacians проявилась регуляция экспрессии генов вирулентности.

В то же время корни A thaliana показали дифференциальную экспрессию генов в ответ на совместное культивирование. После 72 часов совместного культивирования 35 соединений были усилены, а 76 соединений уменьшились в секретоме инокулированных растений по сравнению с контролем. Этот метод открывает исследователям путь к изучению взаимодействий растений и микробов и изучению взаимных реакций между растениями и микробами или микробами-партнерами по биому, или реакций растений на абиотические факторы в простой структуре, которая точно имитирует естественную среду.

Мы надеемся, что после просмотра этого фильма вместе с вами вы сможете создать систему совместного культивирования микроорганизмов растений в гидропонике для изучения молекулярных растений, микробных взаимодействий и сигнальных реакций в более естественной и управляемой среде.