Настройка режимов сократимости и деформации активных сборок на основе актина in vitro: от двумерных активных сетей до жидкокристаллических капель

Это исследование сосредоточено на мягких биологических материалах и направлено на изучение основных физических механизмов, регулирующих форму и организацию, а также материалов, вдохновленных биологическими клетками.

Биологические и модельные системы in vitro по своей природе сложны и содержат множество подводных камней, и подготовка образцов имеет решающее значение для их воспроизводимости. Этот протокол предназначен для улучшения воспроизводимости в этих системах.

Эти результаты прокладывают путь к обнаружению, характеристике механизмов и пониманию функции физических сил и биоматериалов. Это может быть обобщено на различные биополимеры и органеллы.

[Рассказчик] Для начала подготовьте образец к загрузке, добавив пять микролитров буфера 10XF в микроцентрифужную пробирку и добавив объем деионизированной дистиллированной воды таким образом, чтобы окончательный объем образца составил 50 микролитров после добавления остальных компонентов. Пипеткой внесите в раствор один микролитр 25% бета-меркаптоэтанола, один микролитр 225 мг на миллилитр глюкозы, один микролитр смеси глюкозооксидазы и катализатор в концентрации 85 000 ЕД на миллилитр. Затем добавляют один микролитр 25 миллимолярной АТФ и 10 микролитров 2%, 15 сантипуаз метилцеллюлозы, и тщательно перемешивают пипетированием. Чтобы начать полимеризацию актина, смешайте немеченый актин с меченым актином и добавьте смесь актинов в приготовленный буферный раствор F. Подавайте раствор пипеткой вверх и вниз, чтобы обеспечить правильное перемешивание. Оставьте актин полимеризоваться при комнатной температуре в микроцентрифужной пробирке. Далее, чтобы подготовить проточную ячейку, поместите два куска двустороннего скотча параллельно друг другу по ширине предметного стекла микроскопа, чтобы сформировать границы канала проточной ячейки. Расположите защитный колышек над каналом ленты так, чтобы он был перпендикулярен предметному стеклу микроскопа. Надавите на область защитного стекла, которая соприкасается с двусторонней лентой, чтобы обеспечить хорошее уплотнение и устранить воздушные карманы. С помощью лезвия бритвы обрежьте все излишки ленты со предметного стекла микроскопа и закройте крышку так, чтобы единственная видимая лента находилась в канале образца. Чтобы подготовить камеру для отбора образцов баллона для двух образцов депланера, сначала промойте крышку этанолом, водой и этанолом. Высушите его отфильтрованным воздухом. Нанесите тонкий слой пятиминутной эпоксидной смолы, чтобы приклеить цилиндр для клонирования стекла к покровному стеклоу. Добавьте 3,5 микролитра раствора масляного поверхностно-активного вещества в прозрачную или светлую микроцентрифужную пробирку. Не перемешивая, нанесите пипеткой пять микролитров раствора актина на верхний слой масляного поверхностно-активного вещества. Закройте трубку. Возьмитесь за верхнюю часть пробирки микроцентрифуги и поверните нижний край, чтобы образовалась начальная пена с видимой эмульсией, и продолжайте взмахивать, пока не образуются однородные микроэмульсии. Перед загрузкой проточной ячейки смешайте небольшое количество пятиминутной эпоксидной смолы. Чтобы загрузить проточную ячейку, нанесите пипеткой от одного до трех микролитров раствора масляного поверхностно-активного вещества в канал для образца проточной ячейки, чтобы создать небольшую пробку, которая смачивает канал. Перед добавлением образца наклоните проточную ячейку, чтобы удалить воздушную прослойку, образующуюся из-за отступающего мениска масляного поверхностно-активного вещества. Немедленно пипеткой нанесите раствор образца эмульсионной суспензии во вход проточной ячейки для заполнения канала. Загерметизируйте каждую сторону канала проточной ячейки пятиминутной эпоксидной смолой. Чтобы загрузить камеру для образцов цилиндра для образцов без эмульсии, нанесите пипеткой пять микролитров раствора поверхностно-активного вещества масла на дно стеклянной камеры цилиндра. Наклоните и медленно поверните защитный листок, чтобы покрыть поверхность и нижний цилиндр раствором поверхностно-активного вещества. Удалите излишки раствора поверхностно-активного вещества с помощью пипетки для получения тонкого слоя, не допуская при этом полного испарения масла. Сразу же добавьте раствор образца в камеру. Накройте камеру небольшим кусочком политетрафторэтилена, или ленты из ПТФЭ, чтобы предотвратить испарение и течение. Установите образец на предметный столик микроскопа. Начните покадровую съемку актина с помощью объектива с 20-кратным, 40-кратным, 60-кратным или 100-кратным увеличением с масляной или водяной иммерсией, чтобы обеспечить достаточно высокую числовую апертуру для визуализации с высоким разрешением. При полимеризации в камере для образцов дайте полимеризации в течение примерно 30 минут или до тех пор, пока не исчезнет видимое удлинение или движение нити. Добавьте к образцу сшивающий агент, затем добавьте миозин в виде предварительно полимеризованных нитей, медленно впрыскивая в образец примерно половину общего объема. Наконец, запустите визуализацию замедленной съемки. Здесь показано репрезентативное конфокальное флуоресцентное изображение запутанной актиновой сети. Запутанная актиновая сеть равномерно распределена по поверхности. Яркие пятна на этом изображении представляют собой наложения нитей, в то время как темные области указывают на минимальное присутствие актина. Тепловые колебания приводят к местным изменениям интенсивности и видимому изгибу актиновых нитей. Добавление миозина II вызывает изгиб и реорганизацию актиновой сети с видимым накоплением миозина точечного в течение длительного времени. Сокращение сети зависит от концентрации миозина и концентрации АТФ. В сшитых актиновых сетях индуцированное миозином сокращение приводит к скоординированному движению в более длинных масштабах по сравнению с запутанными сетями.