Разработка подхода на основе микрофлюидики для исследования механики полимеров микротрубочек

Микротрубочки — это цитоскелетные полимеры, которые играют важную роль в делении клеток и внутриклеточном транспорте. В этом исследовании мы применяем микрофлюидики для изучения механики микротрубочек in vitro. Эта работа направлена на устранение двух конкретных ограничений для изучения микротрубочек в микрофлюидных устройствах: потенциал пузырьков воздуха, которые могут денатурировать белки, и отсутствие использования высокопроизводительных анализов. Наше микрофлюидное устройство и протокол позволяют использовать ряд экспериментальных установок с более надежными возможностями тестирования с высокой пропускной способностью, чем наши предыдущие анализы проточных ячеек.

[Инструктор] Для начала плазма очищает трехдюймовую кремниевую пластину под вакуумом в течение пяти минут, используя либо кислород, либо чистую плазму сухого воздуха. Следите за тем, чтобы давление вакуума было ниже пяти умножить на десять в степени минус пять торр. Центрируйте чистую кремниевую пластину на спин-кодировщике для нанесения фоторезиста и нанесите один-два миллилитра фоторезиста SPR 227.0 на центр кремниевой пластины. Нанесите на фоторезист слой толщиной 13 микрометров со скоростью 1000 оборотов в минуту в течение 30 секунд. Минимизируя контакт с поверхностью с покрытием, перенесите кремниевую пластину на нагревательную пластину, настроенную на 70 градусов Цельсия. Инкубируйте кремниевую пластину на горячей плите, повышая температуру на 10 градусов Цельсия каждые три-пять минут, пока температура не достигнет 115 градусов Цельсия. Затем выключите конфорку и дайте кремниевой пластине остыть, пока ее температура не опустится ниже 65 градусов по Цельсию. С помощью щипцов перенесите остывшую пластину на выравниватель маски. Загрузите в юстировщик кремниевую пластину и соответствующую фотомаску в соответствии с протоколами производителя или конкретного места, теперь подвергните пластину воздействию ультрафиолетового излучения с энергией примерно 400 миллиджоулей на квадратный сантиметр. Рассчитайте необходимое время экспозиции по формуле. После регидратации и термической обработки погрузите пластину в соответствующий проявитель. Затем аккуратно промойте обе стороны пластины деионизированной водой в течение 30 секунд. После сушки разработанной пластины с помощью газообразного азота перенесите ее в эксикатор. Поместите небольшой алюминиевый контейнер в эксикатор и добавьте одну каплю силана в алюминиевый контейнер. После высыхания вылейте смешанный и дегазированный полидиметилсилоксан на главную форму внутри чашки Петри. Инкубируйте чашку при температуре 65 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы PDMS полностью затвердел. Вокруг особенностей устройства с помощью скальпеля или бритвенного лезвия вырезайте прямоугольные кусочки PDMS из мастер-слоя. Убедитесь, что каждая деталь имеет достаточное фланговое пространство для обеспечения надлежащего контакта склеивания и подходит к стеклянной крышке размером 22 на 22 мм. Поместите PDMS на запасной слой PDMS, избегая твердых поверхностей. Затем с помощью чистого 1,5-миллиметрового отверстия проделайте входные и выходные отверстия в каждой детали PDMS. Теперь достаньте стеклянную крышку размером 22 на 22 миллиметра и очистите ее салфеткой, пропитанной изопропиловым спиртом. Затем плазма очистит стеклянную крышку под вакуумом в течение пяти минут с использованием чистого сухого воздуха плазмы. Протрите стеклопакет и функциональную сторону PDMS салфетками с изопропиловым спиртом перед тем, как поместить их в плазменный очиститель и одновременно очистить плазмой в течение 30 секунд под вакуумом с использованием чистого сухого воздуха плазмы. После очистки переверните PDMS так, чтобы его основная сторона была обращена вниз. Поместите PDMS на стеклянную крышку и слегка нажмите, чтобы стимулировать склеивание. Стабилизированные расширения микротрубочек изгибались под действием проточного буферного раствора перпендикулярно направлению их роста, демонстрируя способность прикладывать направленную силу внутри устройства. Приповерхностная скорость потока, испытываемая микротрубочками, была рассчитана как 92 микрометра в секунду с использованием имитационного и аналитического моделирования на основе уравнения Навье-Стокса. Вычислительное моделирование продемонстрировало установление стабильных градиентов на устройстве, что было подтверждено экспериментально флуоресцентным красителем, показывающим предсказуемые модели концентрации. Удлинители микротрубочек с двойной меткой, подтвержденное разделение на основе градиента с различными флуоресцентными белками, доминирующими в отдельных пространственных зонах вдоль устройства.