Подготовка сегментированных микротрубочек исследовать движение приводится в действие разборки микротрубочек Ends

Общая цель данного эксперимента заключается в изучении движения белковых молекул и покрытых белком шариков с концами деполимеризующихся микротрубочек. Это достигается за счет сборки многоразовой проточной камеры с чистым защитным стеклом. Затем подготавливаются семена микротрубочек, которые прикрепляются к покровному листу и используются для зарождения микротрубочек, которые затем временно стабилизируются с помощью фоторазрушаемых колпачков.

Затем меченые GFP белки или гранулы, покрытые белковой оболочкой, вводятся в проточную камеру и связываются с сегментированными микротрубочками. Затем происходит деполимеризация микрованн путем снятия крышек с помощью фотоабляции. Изображения анализируются с помощью CH, чтобы определить, проявляют ли меченые белки поведение по отслеживанию кончика, то есть движение с концами деполимеризующихся микротрубочек.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет запускать микротрубообразование с высоким временным и специальным разрешением. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Протокол начинается с подготовки и сборки проточной камеры с помощью ультразвукового фрезерования.

Модифицируйте обычные предметные стекла микроскопа так, чтобы они имели две бороздки. Сделайте пазы на расстоянии 14 миллиметров друг от друга. Плюс-минус один миллиметр, что оптимально для камер, собранных с использованием квадратных 22-миллиметровых покровных накладных.

Затем поместите полиэтиленовую трубку длиной 100 миллиметров в каждую канавку в предметном стекле, оставив около пяти миллиметровых выступов на внутренних концах канавок. Зафиксируйте трубки внутри пазов с помощью цианоакрилатного клея, полностью заделав трубки внутрь пазов. Аккуратно заполните углубления эпоксидным клеем, чтобы не пролить.

Дайте ему высохнуть в течение суток. На следующий день. Острым лезвием бритвы разрежьте застывший клей в трех-четырех миллиметрах от дистального конца каждого места крепления.

Снятие деталей прокси к центру предметного стекла. Трубки должны оставаться в своих пазах, а срезы должны делать плоские поверхности с отверстиями для трубок. Далее наполните шприц водой и проверьте, исправно ли работают трубки.

Если жидкость течет свободно, нанесите каплю эпоксидного клея диаметром около пяти миллиметров на внешние концы канавок и дайте ей высохнуть около суток. Таким образом, готовые проточные камеры долговечны и могут использоваться многократно в течение многих месяцев. Этот трехчасовой протокол готовит 12 бланков прикрытия.

Для этого требуется вытяжной шкаф, одна керамическая крышка-держатель, три банки по 15 миллилитров для окрашивания и 1 стеклянная банка объемом 250 миллилитров с крышкой. В баночки для окрашивания должно поместиться четыре, штатные No 1 22 миллиметровые крышки в стопку. Начните со стопки из 12 предварительно очищенных и высушенных защитных колпачков в керамическом держателе.

Наполните банку плюс один отталкивающим силеновым раствором и медленно опустите горки. Закройте банку и выдержите ее в течение пяти минут при комнатной температуре. Наиболее важным шагом для обеспечения равномерной цивилизации покровных слипов является исключение любых следов воды во время инкубации покровных слипов в растворе Селена.

Этот шаг необходим для плотного прикрепления семян микротруб. Далее в протоколе, когда крышка будет готова, извлеките керамический держатель из банки. Затем переносите крышки по отдельности с помощью пинцета с тефлоновым покрытием из керамического держателя в банки для окрашивания с метанолом.

Теперь загрузите три банки в резервуар для воды звуковой ванны, в котором установлен металлический или стеклянный постамент. Уровень воды должен быть на двух третях высоты банок ультразвуковой обработкой банок на 70 Вт в течение 20 минут. Во время ультразвуковой обработки меняйте раствор метанола каждые пять минут.

Когда ультразвуковая обработка будет завершена, промыть, чехол скользнет 10 раз деионизированной водой. Если силосование сработало правильно, то покровные стекла будут казаться сухими При извлечении из воды, независимо от внешнего вида, тщательно удалите остатки воды. С помощью переноса газообразного азота высушенная крышка перемещается в герметичный контейнер, высушенный азотом.

Прокладки Interlay Kim между накладками крышки. Хранить их таким образом можно несколько недель при комнатной температуре. Этот протокол требует одного-двух часов, одной проточной камеры и подготовленных стабилизированных микротрубчатых семян G-M-P-C-P-P.

Сначала соберите проточную камеру. Прикрепите два куска двустороннего скотча вдоль центральной области шириной пять миллиметров подготовленной горки и плотно прижмите защитный скотчек к ленте. С помощью одномиллилитрового шприца заполните камеру 100 микролитрами раствора B rrb 80 через трубку.

Далее выдавите небольшую каплю двухцветного быстролитого герметика на небольшую пластиковую чашку Петри. Быстро и тщательно перемешайте его зубочисткой. Он станет зеленым.

Нанесите герметик сразу по всем краям покровного стекла. Проверьте, не проникает ли герметик слишком глубоко под защитное стекло. Если трубка заблокирована, отключите шприц от сети и поднимите трубку, чтобы слегка надавить, чтобы предотвратить утечку герметика Через 10 минут убедитесь, что поток раствора не ограничен.

Затем перенесите камеру на нагретый предметный столик микроскопа при температуре 32 градуса Цельсия. Подсоедините одну из трубок к насосу для удаления раствора. Погрузите свободный конец входной трубки в флакон диаметром 0,5 мм с теплым буфером BRB 80.

Установите насос на 100 микролитров в минуту и по мере необходимости используйте его для аккуратного выталкивания пузырьков воздуха. Это также можно сделать вручную. Теперь с помощью насоса загрузите 30 микролитров теплых антител к антигену.

Выключите насос и подождите пять минут. Выключайте насос во время всех инкубаций. Далее промойте камеры примерно 100 микролитрами теплого b rrb 80.

Затем перфузируйте 50 микролитров 1%onic F1 27 в BRB 80. Подождите 10 минут, чтобы он заблокировал гидрофобную поверхность силосного покровного стекла. Теперь промойте камеры со 100 микролитрами буфера подвижности.

Далее уменьшите частоту вращения насоса до 15 микролитров в минуту и перфузируйте камеру от 30 до 40 микролитров микротрубочек, разведенных в буфере для подвижности семян от одного к 200 до одного к 600. Инкубируйте семена в течение 15 минут, затем промойте камеру 400 микролитрами буфера подвижности со скоростью 100 микролитров в минуту, чтобы удалить любой несвязанный материал. Далее уменьшите скорость насоса до 30 микролитров в минуту и перфузируйте камеру предварительно подогретым раствором тубулина без маркировки.

Наиболее важными аспектами этого протокола являются предотвращение образования пузырьков воздуха. Использовать свежеприготовленные растворы тубулина и соблюдать точное время протокола, особенно во время укупорки микроканальцев. Контролируйте рост микротрубок с помощью оптики DIC в течение пяти-семи минут инкубации.

Микротрубочки обычно вырастают примерно на 10 микрон, быстро заменяют раствор на довоенный Rumine Tubulin Mix и позволяют увеличить время инкубации на 8-10 минут. Хорошо промойте камеру 100 микролитрами буфера подвижности со скоростью 20 микролитров в минуту для удаления турбулентности и нуклеотидов, а также растворимых фрагментов микротрубочек. Затем перфузируют камеру подогретым раствором белка, меченного GFP, или гранул, покрытых белковой оболочкой, и приступают к визуализации кинетического компонента дрожжей DAM с меченным GFP способом, очищенным от бактериальных клеток и используемым в качестве положительного контроля для анализов отслеживания зонда.

Такие белки прослеживаются вместе с деполимеризующимся концом микротрубочки и неуклонно движутся к покровному листку, прикрепленному к семени. Эти белки отображаются в виде косой линии на соответствующем графике, который затем может быть проанализирован для определения количества белковых молекул в комплексе отслеживания зонда. Этот анализ подробно описан в текстовом протоколе.

Напротив, белки, которые не могут наклонить траекторию, не демонстрируют обогащения флуоресцентным сигналом на дизассемблирующем микроконце. Это видно на примере человеческого белка NDC 80 GFP. Связь между покрытыми белком бусинами и микротрубочками обычно довольно прочная, поэтому, когда бусины добавлялись в камеру для микроскопии, они легко связывались с сегментированными покровными трубочками, прикрепленными к ним.

Когда отслеживание швов является процессивным, можно сделать множество наблюдений. Бусины, прикрепленные к одной микротрубочке, демонстрировали дугообразное движение, поскольку микротрубочки слегка поворачиваются вокруг места своего роста. Когда стабилизирующий колпачок подсвечивается, если дистальнее семени и бусины виден только один красный сегмент, то бусина прикрепляется к одной микротрубочке.

Колпачок часто можно увидеть, как он следует за движением бусин до тех пор, пока колпачок не будет обесцвечен Движение бусин вскоре после отбеливания выглядит соответствующим ориентации микротрубочек. По мере того, как микротрубка укорачивается и шарик движется к семени, амплитуда дуговых колебаний уменьшается. Если бусины не образуют прочных прикреплений к стабильным микротрубочкам.

Лазерная ловушка может быть использована с помощью бусин с различными белковыми конструкциями плюс направленного кинезина SE E, необходимого для запуска бусин на сегментированные стенки микротрубок в присутствии ТП. Эти бусины быстро двигались к закрытым концам микротрубки плюс на графике. Это движение приводило к тому, что после разрушения колпачка была направлена косая линия, направленная в сторону колпачка. Бусины, покрытые усеченным шпионским белком, отделились от микротрубочки, как указано зеленой стрелкой.

Напротив, бусины с белком B полной длины могут поддерживать движение в обратном направлении. Это выглядит как зигзагообразная картина на графике CHM из-за движения в противоположных направлениях к плюсовому и или минусовому концу микротрубочек. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как подготовить проточные камеры и вырастить сегментированные микротрубочки для изучения движений, вызванных разборкой микротруб.