Разделение и дифференциальная характеристика кишечных микробных внеклеточных везикул у чувствительных к соли крыс в условиях диеты с высоким содержанием соли

В этом исследовании изучается роль кишечных микробных внеклеточных везикул у чувствительных к соли гипертоников крыс на диете с высоким содержанием соли, изучается, как диета с высоким содержанием соли изменяет везикулы и влияет на гипертензивные и иммунные взаимодействия. Последние достижения в этой области включают понимание роли кишечных микробных внеклеточных везикул при гипертонии, оценку влияния диет с высоким содержанием соли на микробное разнообразие и внедрение растительных вмешательств, направленных на везикулы метаболической и иммунной регуляции. Текущие экспериментальные задачи включают выделение высокоприоритетных внеклеточных везикул, различие также полученных везикул из везикул микробиома, минимизацию потерь образцов в стандартных протоколах окрашивания для обеспечения воспроизводимости между исследованиями. Эта сетка плотности и протокол центрифугирования обеспечивают более высокий приоритет внеклеточных везикул с улучшенной целостностью и воспроизводимостью по сравнению с традиционными методами, что позволяет проводить более надежные исследования внеклеточных везикул кишечного микробиома в исследованиях гипертензии.

[Рассказчик] Для начала переложите пять граммов кала в предварительно взвешенную 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Добавьте в трубку 50 миллилитров предварительно нагретого до 37 градусов Цельсия PBS без эндотоксина и вращайте трубку в течение 30 минут. Охладите высокоскоростную центрифугу до 4 градусов Цельсия. Затем поместите образец симметрично в центрифугу и вращайте при температуре 8 000G в течение 15 минут. После центрифугирования отобрать надосадочную жидкость и перенести ее в новую стерильную центрифужную пробирку. После повторного центрифугирования в течение 15 минут осторожно отаскайте надосадочную жидкость и используйте ее для дальнейшего анализа. Поместите на лед стерильный фильтрующий блок размером 0,22 микрометра. Перенесите надосадочную жидкость на верхнюю часть фильтра и включите вакуумный насос для сбора отфильтрованных образцов. Переведите фильтрат в центробежный фильтр с отсечкой 10 килодальтон и емкостью 15 миллилитров. Центрифугируйте при температуре 4 градуса Цельсия 3000G в течение 30 минут, чтобы сконцентрировать образец не менее чем до 1400 микролитров. Сразу же поместите образец на лед. Смешайте один объем градиентного буфера А с пятью объемами градиентной среды плотности для приготовления рабочего раствора. Приготовьте 10% раствор йодиксанола, смешав одну единицу рабочего раствора с четырьмя единицами буфера В. Аналогично смешайте две единицы рабочего раствора с тремя единицами буфера В для 20% раствора йодиксанола и четыре единицы рабочего раствора с одной единицей буфера В для 40% раствора йодиксанола. Теперь смешайте подготовленный ранее концентрированный образец с семью миллилитрами градиентной среды для получения 50% раствора йодиксанола. Чтобы приготовить градиент плотности, добавьте раствор трипанового синего в 40% и 10% растворы йодиксанола. Перелейте восемь миллилитров 50% раствора йодиксанола на дно тонкостенной полипропиленовой центрифужной пробирки. Наклоните трубку на 70 градусов и перенесите на поверхность жидкости восемь миллилитров 40% раствора йодиксанола. Затем добавьте восемь миллилитров 20% раствора йодиксанола, затем семь миллилитров 10% раствора йодиксанола и два миллилитра PBS без эндотоксина. Возьмите подготовленную пробирку с градиентом плотности и поместите ее в предварительно охлажденную ультрацентрифугу. Установите параметры ультрацентрифугирования на 100 000G, 20 часов и 10 градусов Цельсия и начните запуск. Для ручного разделения плотности градиента для коллекции градиент плотности составляет около 34 миллилитров жидкости. Два миллилитра раствора медленно извлекаются из центра поверхности жидкости, и каждые два миллилитра раствора представляют собой градиент. Таким образом, решение градиента плотности делится на 17 градиентов. Наконец, с помощью пипетки перенесите фракции плотности в стерильные пробирки с образцами и сразу же поместите их на лед. Анализ с помощью нано-трекинга частиц выявил размер, распределение и профили концентрации внеклеточных везикул, собранных из различных фракций градиента плотности. Большинство внеклеточных везикул во всех фракциях были сосредоточены в диапазоне размеров от 30 до 100 нанометров в соответствии с типичной схемой распределения. Концентрация внеклеточных везикул достигла своего наивысшего уровня в девятой фракции, достигнув пика примерно в 3,85 умножить на 10 в степени девяти частиц на миллилитр. Содержание белка, измеренное с помощью набора бицинхониновой кислоты, также было самым высоким в девятой фракции и составило 0,417 микрограмма на микролитр. Кроме того, уровни экспрессии липополисахаридов, определенные с помощью набора для детектирования эндотоксинов, были значительно повышены в фракциях 9 и 10. Большее количество белка также наблюдалось в девятой фракции во время анализа электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия. Просвечивающая электронная микроскопия, или ПЭМ-изображения, выявила внеклеточные везикулы, обладающие круглой мембраноподобной морфологией.