Количественная оценка поглощения эндотелиальных жирных кислот с использованием флуоресцентных аналогов жирных кислот

Вещества, передаваемые в кровь, такие как жирные кислоты, должны пересекать капиллярный эндотелиальный барьер и попасть в метаболические ткани через плохо изученные механизмы. Прояснение этих процессов может выявить новые терапевтические цели для лечения метаболических заболеваний, таких как сахарный диабет 2 типа. Мы обнаружили, что мышцы скальпеля и жировая ткань регулируют поглощение и транспорт эндотелиальных липидов с помощью паракринных метаболитов, частично контролируемых эндокринной системой.

Также мы обнаружили, что митохондриальный АТФ неожиданно способствует поглощению эндотелиального жира, несмотря на их известную зависимость от гликолитического АТФ. Используя анализ, изложенный в этом протоколе, мы планируем глубже изучить молекулярные механизмы, лежащие в основе поглощения и транспортировки эндотелиальных жирных кислот, включая их регулирование другими тканями. Для начала приготовьте раствор с 0,1% желатина, добавив 25 миллилитров 2% желатинового бульона к 475 миллилитрам PBS.

Тщательно перемешайте желатиновый раствор и простерилизуйте фильтром с помощью вакуумного фильтра или автоклава объемом 0,2 микрометра. С помощью пипетки добавьте 100 микролитров раствора желатина 0,1% в каждую яме чёрной прозрачной нижней пластины на 96 лунок. Поставьте тарелку в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия минимум на 30 минут или на ночь.

После инкубации удалите лишний раствор желатина из предварительно покрытой пластины на 96 лунок. Помой тарелку PBS один раз. Затем пипеткой вводите 100 микролитров суспензии клетки в каждую яму, используя плотность посева, которая позволяет клеткам достигать слияния к следующему дню.

Приготовьте 20-миллимолярные растворы 3-гидроксиизобутирата и лактат в качестве положительных контролей. Для отрицательного контроля используйте один микромолярный никозамид. Затем пипетить растворы в отдельную пластину на 96 лунок.

Промыйте эндотелиальные клетки один раз предварительно подогревшей двухвалентной PBS, пипетируя под крутым углом, чтобы не нарушать работу пластинчатых клеток. Добавьте по 50 микролитров в каждую ямку соответствующего реагента и инкубируете пластину при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут или 60 минут. Для приготовления комплекса BODIPY жирной кислоты BSA смешайте 2-микромолярный раствор жирных кислот BODIPY с 1 микромолярным BSA без микромолярных жирных кислот в PBS.

Инкубировать смесь при комнатной температуре в темноте 10 минут перед использованием. Затем добавьте 50 микролитров приготовленного комплекса BSA на основе жирных кислот BODIPY в каждый хорошо обработанный и инкубируете тарелку при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут. Приготовьте 1 микромолярный раствор BSA без жирных кислот в PBS в качестве буфера для промывки и предварительно прогрейте его до 37 градусов Цельсия.

Удалите комплекс BSA с жирными кислотами BODIPY из колодцев и дважды промыйте всю тарелку 50 микролитрами предварительно подогреного буфера для стирки, выполняя каждую промывку в течение 1,5 минуты. Затем добавьте 50 микролитров 0,08% трипан-синего в каждую яму, чтобы закалить внеклеточную флуоресценцию. С помощью считывателя микропластин немедленно измеряйте внутриклеточную флуоресценцию.

После удаления раствора Trypan Blue из колодцев аккуратно промыйте клетки PBS. Добавьте 4 микрограмма на миллилитр красителя Hoechst, разбавленной в 10% медиа в каждую скважину. Инкубировать тарелку при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут.

Затем один раз промой тарелку с помощью PBS, чтобы удалить лишний краситель. После этого добавьте свежий PBS в каждую скважину и измерьте флуоресценцию Хёхста с помощью считывателя микропластин. В клетках HUVEC и EA.hy926 внутриклеточный сигнал BODIPY-C12 значительно увеличивался при повышении концентрации жирных кислот BODIPY через одну минуту, пять и десять минут инкубации.

Лечение лактатом в течение одного часа увеличивало поглощение BODIPY-C12 в зависимости от дозы при концентрациях 5 миллимолярных и 20 миллимолярных частиц. Лечение 3-гидроксиизобутиратом также значительно улучшило поглощение BODIPY-C12 в зависимости от дозы, при этом наибольшее поглощение наблюдалось на 20 миллимолярах. Лечение 1 микромолярным никозамид в течение 30 минут привело к значительному снижению поглощения BODIPY-C12 по сравнению с нелеченой контролю DMSO.

После пятиминутной инкубации с BODIPY-C16 в HUVEC, лечение лактатом на 10 миллимолярных и 20 миллимолярных интервалах значительно увеличивает поглощение в зависимости от дозы. Лечение 1 микромолярным никозамидом значительно снизило поглощение BODIPY-C16 по сравнению с нелеченым контролем DMSO.