Разработка и определение характеристик In Vitro Микрососудов Сеть и количественные измерения эндотелиальной [Са ²⁺] _я И оксид азота Производство

Общая цель этой процедуры заключается в разработке микрофлюидного устройства, которое позволяет эндотелиальным клеткам расти под действием физиологически значимого сдвигового потока и измерять вызванные агонистами изменения в их продукции кальция и оксида азота. Это сообщение может помочь продвинуть будущее исследований микрососудов, подтвердив модель микрососудов in vitro и сократив разрыв между исследованиями in vivo и in vitro. Основными преимуществами данной методики являются универсальная конструкция микроканалов для имитации различных сосудов и улучшение среды культивирования клеток, которая ближе к in vivo, чем условная статика к исходным культурам.

Демонстрировать процедуры будут Сулей и Сян, двое из моей лаборатории. Прежде чем начать, используйте стандартную фотолитографию для создания мастер-формы и мягкую литографию для изготовления микроканальных устройств PDMS, как описано в текстовом протоколе. Чтобы подготовить микроканальные устройства, сначала накройте вход и выход тонким кусочком PDMS и поместите устройство в чашку Петри с влажной салфеткой.

Затем оберните посуду парапленкой и простерилизуйте прибор под ультрафиолетовым светом не менее трех часов. Следующим шагом является применение фибронектина. Сначала нанесите каплю от 30 до 50 микролитров PBS на входе.

Создайте вакуум на выходе для промывки устройства. Далее поместите каплю 100 микрограмм на миллилитр фибронектина на входное отверстие. Создайте вакуум на выходе для загрузки раствора фибронектина.

Далее закройте входное и выходное отверстие. Снова оберните чашку парапленкой и выдержите устройство в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день вручную прополощите прибор PBS три раза.

Затем загрузите в него от 30 до 50 микролитров среды для клеточных культур и прогрейте устройство в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 15 минут. Начните с смешивания HUVEC с питательными средами HUVEC с восемью процентами декстрана в концентрации от двух до четырех миллионов клеток на миллилитр. Декстран необходим для увеличения вязкости и, таким образом, улучшения засева клеток.

Затем поместите от 10 до 20 микролитров клеток над входным отверстием и введите их под действием силы тяжести или с помощью капиллярного воздействия из стеклянной пастерной пипетки на выходе. Далее инкубируйте устройство в течение 15 – 20 минут. Затем проверьте состояние посева под микроскопом.

При необходимости загрузите больше ячеек для достижения желаемой плотности ячеек. Как только будет загружено достаточное количество клеток, аккуратно промойте устройство обычной теплой средой для культивирования клеток, чтобы удалить декстран. Затем культивируйте устройство без какой-либо перфузии в течение шести часов.

Затем настройте соединения трубок для длительной перфузии. Прикрепите устройство к чашке Петри, а затем подсоедините входную трубку к шприцу с помощью иглы. Вставьте трубку как во входное, так и в выходное отверстие устройства.

Подсоедините выпускную трубку к мусоросборнику. Теперь поместите тарелку и контейнер для отходов в инкубатор. Подсоедините шприц с помощью длинной входной трубки к внешнему перфузионному насосу, который проходит через дверцу инкубатора.

Затем установите скорость перфузии в соответствии с планом эксперимента. При хорошо контролируемой перфузии культура в сети микрососудов может сохраняться до двух недель. Таким образом, он может быть расширен до более долгосрочных исследований, имитирующих клеточную и гемодинамическую среду при различных физиологических и патологических состояниях.

Чтобы начать иммуноокрашивание, такое как мечение VE-кадгерином, сначала зафиксируйте клетки путем перфузии двухпроцентным параформальдегидом в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После серии перфузией для блокирования, проникновения и окрашивания антителами держите устройство при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока клетки не будут визуализированы. Чтобы изобразить концентрацию кальция в клетках, перфузируйте устройство с 10 миллиграммами на миллилитр альбумина в растворе Рингера в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Далее перфузируйте прибор пятью микромолярами Fluo-4 AM в течение 40 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем промойте связанный просвет Fluo-4 AM с альбумином Ringers в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем запустите конфокальную систему для визуализации межклеточного уровня кальция с помощью Fluo-4 AM. Получение изображений микрососудов, загруженных Fluo-4.

Собирайте базовые изображения в течение 10 минут. Затем непрерывно перфузируйте прибор 10 микромолярными АТФ и записывайте изменения интенсивности флуоресценции в течение 20 минут. Чтобы изобразить образование оксида азота в клетках, перфузируйте устройство с альбумином Рингера в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем перфузируйте клетки 5 микромолярами DAF-2 DA в течение примерно 35-40 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем настройте систему флуоресцентной визуализации для измерения индуцированного АТФ производства оксида азота. Запишите исходный уровень в течение 5 минут, затем перфузируйте устройство 10 микромолярными АТФ и собирайте изображения в течение 30 минут с интервалом в одну минуту.

Для измерения оксида азота в клетке важно понимать, что адаптер для отсоединения профиля интенсивности представляет собой кумулятивное образование оксида азота с течением времени, а не концентрацию оксида азота. Вручную выберите область интересов из собранных изображений на уровне отдельной ячейки. Каждый ROI охватывает площадь одной отдельной ячейки, которая может быть обозначена контуром floresense.

Количественно оцените индуцированные АТФ изменения в эндотелиальном кальции и оксиде азота. При расчете изменения флорезенсной интенсивности Fluo-4 за вычетом тканевого фона. Количественно оцените скорость образования закиси азота путем проведения первого дифференциального преобразования флоресенсной интенсивности DAF-2 с течением времени.

Микроканальный шаблон в устройстве имеет трехуровневую разветвленную сеть. Было выполнено численное 3D-моделирование для оценки распределения напряжений сдвига при скорости потока 0,35 микролитра в минуту. Эндотелиальные клетки засеивались в сеть, как описано.

Затем F-актин и ядра были помечены. Аналогичным образом, VE-кадгерин также окрашивался. Результаты были аналогичны экспрессии VE-кадгерина в интактной венуле.

Затем было изучено индуцированное АТФ увеличение внутриклеточной продукции кальция и оксида азота. Уровень кальция исследовали с помощью Fluo-4 AM, как описано в разделе протокола. Производство оксида азота контролировали с помощью DAF-2 DA, как описано в разделе протокола.

Результаты были сопоставимы с результатами, полученными с индивидуально перфузированными интактными венулами. Продвинутые методы были легко и жестко контролировались в биологических условиях и динамичных жидкостных средах, что было бы невозможно с обычными методами микронавыков. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготавливать устройство, а также выполнять измерения кальция и оксида азота.

После этого метод проложил путь исследователям не только к исследованию основных индуцированных агонистов, но и к более широкому применению биомедицинских исследований.