Визуализация и количественная оценка потенциала дифференциация адипогенном мезенхимальных клеток с маркером конкретных Lineage

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации и количественной оценке дифференцировки стромальных клеток в адипогенную линию с использованием специфичного для линии маркера белка, связывающего жирную кислоту белка 4. Это достигается путем выделения и расширения интересующих стромальных клеток. Затем стромальные клетки собирают и помещают в стандартные культуральные планшеты in vitro.

После инкубации в течение нескольких дней клетки обрабатывают средой для адипогенной дифференцировки. Клетки инкубируются в течение 14 дней, с регулярной заменой сред. После дифференцировки клетки фиксируются и окрашиваются антителами против белка, связывающего жирные кислоты 4.

Автоматизированный скрининговый иммунофлуоресцентный микроскоп с высоким содержанием используется для получения изображений меченых клеток в микролуночных планшетах. Затем дифференциация количественно оценивается с помощью специализированного программного обеспечения для анализа изображений. В отличие от традиционных методов измерения адипогенной дифференцировки с использованием красителей, таких как Oil Red O, анализ, описанный в этом видео, использует антитело против специфичного для линии белка, связывающего жирную кислоту 4, для подтверждения адипогенной дифференцировки.

При этом этот метод количественно оценивает изменения в экспрессии генов, которые соответствуют адипогенной дифференцировке. Этот анализ способен предоставить множество информации, включая процент дифференцированных клеток, интенсивность сигнала флуоресценции на клетку и изменения в морфологии клеток. Способность анализировать множественные характеристики позволяет идентифицировать потенциальные тонкие изменения в дифференцировке в ответ на различные методы лечения.

Этот анализ также обладает высокой пропускной способностью, что делает его идеальным для скрининга лекарств с высоким проходным вытягиванием. Ресуспензируйте клетки в полной среде ASC, которая представляет собой базальную среду DMEM/F-12, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, GlutaMAX и антибиотиков. Пипетку в 96-луночный планшет для культивирования, по 5000 клеток в лунке.

На каждого донора необходимо восемь скважин. Четыре скважины получают контрольную среду, а остальные – дифференцировочную среду. Каждая четвертая скважина каждой обработки будет служить первичным контролем узла.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов, увлажненные атмосферными условиями 5% углекислого газа в течение четырех дней. Это необходимо для того, чтобы клетки могли расти до слияния в каждой лунке. На четвертый день достаньте тарелки из инкубатора.

Удалите половину среды из каждой лунки. Добавьте равный объем полной среды ASC или среды адипогенной дифференцировки, которая дополнена инсулином, изобутилметилксантином, дексаметазоном и индометазоном. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов, увлажненную с атмосферными условиями 5% углекислого газа.

Период времени, необходимый для достаточной дифференциации, составляет 14 дней. В течение этого времени пополняйте носители, выполняя смену носителей каждые два-три дня. После дифференцировки выньте тарелки из инкубатора.

Тщательно пипетируйте все среды из каждой лунки. Исправьте клетки, добавив ледяной метанол. Выдерживать в течение пяти минут при комнатной температуре.

Удалите метанол, затем промойте трис-буферным раствором. Блокируйте, добавив 0,25% блокатора казеина. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре.

Удалите казеин, затем промойте трис-буферным раствором. Готовят первичную смесь антител путем разведения антитела к FABP4 в 200 раз в буфере для разведения антител. Добавьте смесь во все скважины, кроме тех, которые зарезервированы для первичного контроля узла.

Вместо этого добавьте в эти лунки буфер для разведения антител. Выдерживать при комнатной температуре в течение одного часа. После инкубации один раз промойте клетки Трис-буферным физиологическим раствором.

Выньте, добавьте свежий буферизованный Трисом солевой раствор и выдерживайте пять минут на качалке. Повторите этот процесс дважды. Приготовьте вторую смесь реантител, разбавив Anti-Rabbit Alexa 488 second rebody в 200 раз в буфере для разведения антител.

Добавьте DAPI, которым помечаются ядра клеток, при окончательном разведении от одного до 2000. Добавьте смесь во все лунки, и оберните тарелку фольгой, чтобы предотвратить фотообесцвечивание. Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут.

После инкубации промойте клетки TBS, и далее два 15-минутных промывки на коромысле. Удалите весь буфер из лунок и добавьте буфер для хранения, дополненный 0,4 мг на миллилитр тимеросала, чтобы предотвратить рост бактерий. Для получения изображений этого биоанализа используется просеивающая машина с высоким содержанием зерна, оснащенная автоматизированным столиком, фокусирующими объективами и фильтрами.

Убедитесь, что установлены правильные фильтры. Очистите дно тарелки для достижения наилучшего качества. Загрузите тарелку в сцену так, чтобы А1 располагался в верхнем левом углу.

С помощью мастера получения пластин запишите важную информацию об эксперименте, такую как номер пластины, увеличение, дата, условия эксперимента и детали маркировки. Выберите тип используемой микролуночной пластины. Пользователи могут выбирать скважины и количество участков для приобретения.

Выберите все скважины для изображения, выделив сетку. Переставьте сцену на самый яркий колодец. Выбор самой яркой лунки гарантирует, что все изображения будут получены со значениями серого пикселя, которые находятся в линейном диапазоне и, следовательно, прямо пропорциональны интенсивности окрашивания.

Если этот шаг не выполнять, то снимки, сделанные в более светлых скважинах, могут быть перенасыщены. Выберите подходящие комбинации каналов, время экспозиции и параметры смещения по оси Z для эксперимента. Фильтры, используемые для визуализации FABP4 и DAPI, соответствуют конкретным меткам, используемым для визуализации окрашивания.

Alexa 488, которая возбуждается на 480 нанометрах и излучает на 560 нанометрах, была использована для визуализации FABP4. А краситель DAPI, который возбуждается на 360 нанометрах и излучает на 460 нанометрах, был использован для визуализации ядра клеток. На пластинах с маркировкой Oil Red O капли жира визуализировались с помощью яркого света, проходящего через топливо.

И этикетка Oil Red O также была визуализирована с помощью флуоресценции, так как она возбуждается на 575 нанометрах и излучает на 630 нанометрах. Когда все настройки завершены, биологический анализ готов к получению. Изображение автоматически сохраняется на онлайн-сервере, чтобы обеспечить простой удаленный доступ к изображениям.

Полный набор изображений, хранящихся на онлайн-сервере, доступен с помощью программы удаленного рабочего стола. Затем изображения могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения MetaXpress. Приложение для оценки клеток позволяет пользователям выбирать длину волны для обнаружения всех ядер в поле, например, DAPI, в данном случае.

Последующие длины волн могут быть использованы для обнаружения положительного маркера либо в ядре, либо в цитоплазме, либо в обоих местах клетки. Четвертый белок, связывающий жирные кислоты, или FABP4, является маркером адипогенной линии. Экспрессия FABP4 локализована в ядре и цитоплазме дифференцированных адипоцитов.

В этом биологическом анализе мы анализируем экспрессию FABP4 с помощью модуля оценки клеток. Во-первых, обнаруживайте ядра клеток с помощью канала DAPI с заданными пользователем параметрами размера и интенсивности сигнала над фоном. Обнаружение сигнала FABP4 с помощью нижнего C-канала и заданных пользователем параметров размера и интенсивности сигнала над фоном.

В этом биологическом анализе капли жира, меченные Oil-Red-O, которые флуоресцируют в диапазоне 560 нанометров, были проанализированы с помощью модуля MetaXpress Transflour. Этот алгоритм анализа обнаруживает целые клетки с использованием меченых DAPI ядер, которые соответствуют критериям размера и интенсивности окрашивания, указанным пользователем. Пользователь также указывает размер и интенсивность ямок, которые в данном случае обнаруживают капли жира в непосредственной близости от клеточных ядер.

Информация о размере капли жира, интенсивности окрашивания, количестве клеток регистрируется с помощью анализа Transflour. Важно отметить, что этикетка Oil Red O действительно вытекала или растворялась из некоторых клеток, потенциально ограничивая и искажая истинную степень дифференцировки. Репрезентативные изображения ранних и поздних пассажных, контрольных и дифференцированных клеток, меченных DAPI, ядерным красителем и FABP4, показаны вместе с изображениями слияния и сегментации.

На изображениях сегментации дифференцированные клетки отображаются с зеленым наложением, а недифференцированные клетки — с красным наложением. Процент клеток, экспрессирующих FABP4, использовался в качестве меры потенциала адипогенной дифференцировки. Наблюдалось значительное увеличение FABP4-экспрессирующих клеток при адипогенной дифференцировке в клетках раннего и позднего пассажа.

Клетки раннего пассажа продемонстрировали значительно большее увеличение дифференцировки, чем клетки позднего пассажа. Репрезентативные изображения DAPI и Oil Red O отображаются вместе со снимками слияния и сегментации. На изображениях сегментации все ядра изображены с зеленым наложением, а капли липидов, окрашенные маслом в красный цвет, — с красным наложением.

В качестве меры потенциала адипогенной дифференцировки использовалась площадь окрашивания Oil Red O на клетку. При адипогенной дифференциации наблюдалось значительное увеличение площади окрашивания Oil Red O. Клетки с ранним пассажем показали большую площадь окрашивания Oil Red O на клетку по сравнению с клетками с поздним пассажем.

Вестерн-блоттинг проводили для анализа уровня экспрессии белка FABP4 дифференцированных ранних и поздних пассажных ИСС. Полуколичественный анализ оптической плотности полос FABP4 в качестве отношения контроля общей белковой нагрузки показал, что иммуномаркировка FABP4 была значительно увеличена при раннем пассаже и в меньшей степени при позднем пассаже дифференцированных клеток. Посмотрев это видео, вы должны получить представление о том, как дифференцировать стволовые клетки в адипогенную линию, как проводить иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием адипогенного ген-специфичного маркера, белка, связывающего жирные кислоты, и, наконец, как визуализировать и анализировать все соответствующие морфологические особенности клеток, которые являются иммуноположительными на четвертый жирнокислотный связывающий белок.

Я надеюсь, что вы найдете это видео полезным для ваших исследований.