Отслеживание отдельных белков в липидных бислоях с помощью флуоресцентной микроскопии

Белки работают в сложном пространстве состояний, и большая часть этого пространства скрыта. Мы используем одиночную визуализацию для выявления этих состояний. При отслеживании белков с одной мембраной в липидном бислое основными трудностями являются подготовка образца, фотоотбеливание и временное разрешение.

Для начала уберите растворы липидных стеблей из морозилки и дайте им достичь комнатной температуры. Достаньте чистую колбу на 10 миллилитров из духовки и дайте ей остыть до комнатной температуры. Добавьте 900 микролитров хлороформата спектроскопического класса и 100 микролитров метанола спектроскопического класса в охлаждённую круглую колбу.

Затем добавьте соответствующее количество каждого липида в колбу и перемешайте, чтобы тщательно перемешать. Теперь поставьте вакуумный дистилляционный коннектор поверх круглой колбы и подключите его к линии сушки азота. Затем включите азотный газ и отрегулируйте давление, пока поток не станет едва ощутным на тыльной стороне руки.

Пипетка — один миллилитр буфера на каждые пять микромолей общего количества липидов в колбу с круглым дном. Положите стеклянную пробку на колбу и запечатайте её керофиновой пленкой. Поставьте флягу и зажим на кольцевую подставку и погрузите её низ в ванну соникатора при температуре 60 градусов Цельсия.

Убедитесь, что раствор становится непрозрачным и липиды не остаются на внутренней стенке колбы. После часовой инкубации включите соникатер и установите амплитуду на максимальный уровень. Двигайте фляжку внутри ванны, чтобы найти место с сильным перемешиванием, где раствор заметно ударяется и распыляется внутри.

Соникуйте раствор в течение 30 минут. Наблюдаем переход от непрозрачного к прозрачному и слегка опалесцентному. Удалите липидный раствор из колбы и перенесите его в микроцентрифугную трубку.

Центрифугуйте трубку при 100 000 G в течение часа при четырёх градусах Цельсия. После центрифугирования удалите и переместите супернатант в новую центрифугную трубку. Поместите 25-миллиметровую кварцевую крышку в стакан и добавьте равные объёмы наночистой воды, 30% перекиси водорода и концентрированной азотной кислоты.

Нагрейте крышку в приготовленном растворе на 30 минут, пока не начнётся пузырьканье. Проверяйте раствор каждые 10 минут и аккуратно поворачивайте, чтобы крышки не склеились. Наблюдайте, как крышка сползает и отделяется во время завихрения.

После разделения постепенно уменьшайте скорость завихрения, чтобы сохранить их разделение и позволяйте пузырькому раствору равномерно покрыть скользящие покрытия. Затем тщательно прополосните крышку очищенной водой, аккуратно покрутите, чтобы удалить все химические остатки. В качестве альтернативы очистите кварцевые накладки с помощью n-гексана, затем метанола, протирая с помощью линзовой ткани для каждого растворителя.

Поместите крышку внутрь очистителя от ультрафиолетового озона, чтобы поверхность была обращена к лампе. Дайте кислороду поступить в камеру с коэффициентом 5 фунтов на квадратный дюйм в течение пяти минут. Затем отключите подачу кислорода.

Теперь включите ультрафиолетовый свет на 15 минут, затем дайте крышкам отдохнуть минимум 10 минут, чтобы озон рассеялся. Поместите только что очищенную крышку в 25-миллиметровый держатель для проб. Используя трубку SM с одной линзой диаметром четверть дюйма, вырежьте двухслойную прокладку пар-пленки диаметром восемь миллиметров и разместите её в центре держателя для образца.

Нанесите 50-микролитровую каплю маленьких пузырьков Unilamellar в центр восьмимиллиметровой прокладки. После герметизации камеры инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. После инкубации используйте пипетку, чтобы промыть раствор.

Добавьте 50 микролитров свежего буфера в бислой и повторите этот процесс всего 10 раз. После финального промывания удалите буфер из держателя для образца. Добавьте 50 микролитров аликвота желаемого белка в детергентном средстве, чтобы концентрация была на уровне или ниже критической концентрации мицеллы.

Инкубировать образец при 37 градусах Цельсия минимум один час для включения белка, затем промыть образец буфером, чтобы удалить невключенный белок и моющее средство. Установите вертикальную скорость смещения пикселей примерно на 600 наносекунд и увеличьте вертикальное тактовое напряжение с помощью режима разгона. Затем настройте горизонтальное считывание пикселей на максимальную скорость.

Отрегулируйте усиление предусилителя на два. Установите выход усилителя для умножения электронов и установите усиление умножителя электронов на максимальный уровень. Затем установите время экспозиции на 25 миллисекунд.

Убедитесь, что фактическая частота кадров немного превышает время экспозиции. Теперь отрегулировать мощность лазера так, чтобы сигнал чётко выделялся на фоне фона. Соберите достаточно данных для изображения, чтобы получить минимум 1000 треков на образец.

Для анализа отслеживания обрезайте все наборы данных до единого размера и выполните коррекцию фона с помощью Image J.In Fiji, перетащите и опустите фильм или стек TIFF, который нужно проанализировать, в интерфейс. Чтобы ввести данные калибровки пикселей, перейдите на вкладку анализа, выберите «задать масштаб» и примените калибровку пикселя к расстоянию, специфичную для конкретного инструмента. Затем сохраните копию набора данных, чтобы сохранить оригинал и отслеживать внесенные изменения.

Вычтите фон из выбранной области интереса и примените его к сохранённой копии оригинальных данных. Перейдите на вкладку «Процесс» и выберите «Вычитать фон». На вкладке плагинов выберите трекинг, затем трекмейт, чтобы запустить диалоговое окно trackmate для анализа трекинга.

Степень маркировки для четырех тетрамеров AQP была рассчитана как 4,12 с использованием УФ-видимой спектрометрии, а анализ распределения Пуассона показал, что 98% тетрамеров несут хотя бы одну молекулу флуоресцентного красителя. Гистограмма показывает широкое распределение размеров шагов, соответствующее диффузии ортогональных массив частиц разного размера, а рассчитанный средний коэффициент диффузии составлял 0,0143 квадратных микрометра в секунду. В этом видео мы выделили ключевые состояния, важные для регуляции аквапорина четыре и связанные с ними термодинамические силы.

Этот протокол устраняет предположения при создании биомиметических мембран с очищенными трансмембранными белками, подходящих для таймлапс-отслеживания отдельных молекул. Белковые машины, работающие в точках перегина, с таймлапсом отслеживания одного белка позволяют непосредственно наблюдать стохастические пути, ветви и тупики.