Summary
La procédure chirurgicale pour la livraison de cellules souches embryonnaires dérivées des cellules endothéliales de la patte postérieure ischémique est démontrée, avec des non-invasive de suivi par imagerie par bioluminescence.
Abstract
Artérielle périphérique maladie (PAD) les résultats de rétrécissement des artères périphériques qui fournissent le sang oxygéné et de nutriments pour les jambes et les pieds, cette pathologie entraîne des symptômes tels que la claudication intermittente (douleur à la marche), des ulcérations douloureuses ischémiques, ou même menaçant le membre gangrène. On croit généralement que l'endothélium vasculaire, une monocouche de cellules endothéliales qui investit la surface luminale de tous les vaisseaux sanguins et lymphatiques, joue un rôle dominant dans l'homéostasie vasculaire et la régénération vasculaire. En conséquence, base de cellules souches de régénération de l'endothélium peut être une approche prometteuse pour le traitement de la MAP.
Dans cette vidéo, nous démontrons la transplantation de cellules souches embryonnaires (CSE) dérivées des cellules endothéliales pour le traitement de l'ischémie unilatérale hindimb comme un modèle de la PAD, suivi par des non-invasive de la cellule de suivi homing et de la survie par imagerie par bioluminescence. Les matériaux et les procédures spécifiques pour la livraison et l'imagerie cellulaire seront décrites. Ce protocole suit une autre publication dans la description de l'induction d'une ischémie des membres postérieurs par Niiyama et al. 1
Protocol
1. La différenciation des CSE de souris en cellules endothéliales
- Le protocole de différenciation en cellules endothéliales CES est décrite ailleurs et n'est pas l'objet de ce protocole 2,3. Brièvement, les cellules sont autorisés à se différencier, et les cellules qui sont positifs pour les marqueurs endothéliaux tels que CD31 ou vasculaire cadhérine endothéliale (VE-cadhérine) sont ensuite purifiées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
2. Construction du gène rapporteur Double Fusion et transduction lentiviraux
- La bioluminescence peut être utilisé pour suivre les cellules qui sont modifiées pour exprimer des gènes rapporteurs tels que la luciférase de luciole (fluctuations). Pour cette application, nos cellules contiennent à la fois fluctuations et amélioré la protéine de fluorescence verte gène de fusion (eGFP) sous le contrôle d'un promoteur interne ubiquitine. En vue de modifier les cellules, le vecteur lentiviral contenant transgène clés optimisés éléments génétiques de remplir les critères de bio-sécurité ainsi que l'efficacité de transduction accrue, UFP-FG vecteur développé dans notre laboratoire portant le gène de fusion fluc-eGFP journaliste peut être utilisé de façon stable transduire les cellules après différenciation. Cette construction de fusion permet à la fois la bioluminescence et de suivi de fluorescence des cellules transplantées. La procédure pour générer des particules virales, la transduction et la production de cellules marquées que les gènes rapporteurs express est décrit ailleurs 4.
3. La transplantation de l'ESC-dérivées des cellules endothéliales de la patte postérieure ischémique
- Commencez la procédure en préparant une souris qui a subi une ischémie des membres postérieurs pour la transplantation de cellules. Pour ce faire, placez la souris dans la chambre de l'induction anesthésique contenant 1-3% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit d'1l/min.
- Laisser la souris dans la chambre de l'induction jusqu'à ce qu'il soit insensible aux stimuli extérieurs. Puis enlever l'animal de la chambre de l'induction.
- Ensuite, placer l'animal dans la position couchée sur la table d'opération et de le connecter à un flux continu de 1-3% d'isoflurane dans 100% d'oxygène à un débit d'1l/min.
- Essuyer la peau de la patte postérieure avec trois gommages bétadine et de l'alcool en alternance.
- Une fois que la peau est nettoyée, obtenir un million ESC dérivées des cellules endothéliales dans 30 ul de tampon phosphate salin (PBS). Chargez ces cellules dans une aiguille de calibre 28.
- Lorsque les cellules sont prêtes, soulevez doucement et d'étendre la patte arrière pour mieux visualiser l'emplacement du muscle gastrocnémien. Alors que la jambe est prolongée, insérez l'aiguille à travers la peau dans le muscle sous-jacent. Prenez soin de ne pas s'approcher de l'os. Doucement et injecter lentement le mélange de cellules 30 uL dans le gastrocnémien. Pour une injection intramusculaire, 30 uL est proche de la limite de volume qui peut être injecté. Par conséquent, de calibre 28 seringues à insuline sont préférés car, dans notre expérience, ils éliminent le volume de perte dans les aiguilles de seringues.
- Après l'injection est terminée, retournez la souris dans la cage de récupération et de le surveiller en continu jusqu'à éveillé. Permettre à l'animal de récupérer pendant plusieurs heures et ensuite procéder à l'en imagerie par bioluminescence in vivo des cellules transplantées.
4. L'imagerie par bioluminescence de l'ESC-dérivée des cellules endothéliales in vivo
- L'ESC transplanté des cellules dérivées endothéliales ont été modifiées pour exprimer les fluctuations et le gène de fusion EGFP sous le contrôle d'un promoteur interne ubiquitine. Par conséquent, la bioluminescence peut être utilisé pour suivre les cellules au sein du membre postérieur ischémique.
- Pour commencer cette étape, mettez le système d'imagerie par bioluminescence et du logiciel d'acquisition image vivante. Puis initialiser le système d'acquisition et de spécifier les dimensions du champ de vision.
- Ensuite, placez le papier noir mat sur la boîte à absorber les émissions d'imagerie de fond.
- Une fois la boîte d'imagerie est prêt, placer la souris dans la chambre de l'induction anesthésique contenant 1-3% d'isoflurane dans de l'oxygène à la sortie de 1l/min. Laisser la souris dans la chambre de l'induction jusqu'à ce qu'il soit insensible aux stimuli extérieurs. Puis enlever l'animal de la chambre de l'induction.
- Enlever les poils des deux membres postérieurs en utilisant un rasoir électrique, si nécessaire.
- Injecter 10 uL de D-luciférine par gramme de poids corporel dans le péritoine. Le D-luciférine est préparé à l'avance dans les solutions de stock filtrée de 15 mg / ml dans le PBS.
- Une fois la luciférine est injecté, placer l'animal dans la boîte d'imagerie sur le papier noir en position couchée, connecté à un flux continu de l'isoflurane.
- Placer les animaux dans la boîte d'imagerie et de la connexion à l'isoflurane.
- Commencez à acquérir des images pendant 10-60 secondes, afin de déterminer un temps d'exposition optimal pour lequel l'image n'est pas saturé. Si l'image devient saturé, de réduire le temps d'exposition. Si le signal de bioluminescence est très faible, augmenter le temps d'exposition.
- Using le temps d'exposition optimale, poursuivre l'acquisition de photos à chaque 1-3 minutes jusqu'à ce que le signal atteint le maximum, puis se fane. Lorsque l'acquisition est terminée, enregistrez le fichier.
- Pour analyser les données, sélectionner des régions d'intérêt (ROI) qui couvrent le site d'injection. Comme témoin négatif, un retour sur investissement similaires peuvent être sélectionnées pour la jambe non opérée. En utilisant le logiciel, mesurer la radiance totale, qui est exprimée en unités de photons / seconde / cm 2 / stéradian (P / S / cm 2 / sr), pour le ROI pour chaque point temporel. La valeur maximale doit être utilisé dans les données finales. Les données peuvent également être exportées vers Excel pour une utilisation future.
- Une fois toutes les données sont acquises, le retour à l'animal de la cage de récupération et de surveiller en permanence jusqu'à ce que le réveil des animaux.
- Répétez cette procédure pour suivre les cellules au cours du temps.
- A un point de temps désiré, l'animal peut être euthanasiés pour l'évaluation de la fonction des tissus.
5. Les résultats représentatifs
Une image représentant la bioluminescence des cellules transplantées dans le membre postérieur gauche ischémique est montré dans la figure 1. Pendant l'acquisition de la bioluminescence, l'intensité va augmenter avec le temps, et la valeur maximale obtenue au cours du temps doivent être déclarés comme la valeur finale.
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Discussion
CES sont une source de cellules prometteuses pour le traitement de l'ischémie tissulaire en raison de leur plasticité de différenciation et de leur capacité à donner naissance à des lignées de cellules comprenant les trois feuillets embryonnaires, dont les cellules endothéliales. Pour surmonter les problèmes éthiques associés avec les CES, cellules souches pluripotentes induites (CISP) peut être une source de cellules souches pluripotentes alternatives qui surmonte les préoccupations éthiques. Outre les CES, les cellules souches adultes comme les cellules progénitrices endothéliales (EPC) et les cellules souches hématopoïétiques (CSH) peut également être utilisé, mais ces types de cellules peuvent avoir limité l'effet thérapeutique chez les patients souffrant de MAP. La livraison par voie intramusculaire de cellules est peu invasive et facile à réaliser, et ce mode de livraison est aussi prête à la prestation de facteurs solubles ou plasmides. Toutefois, pour faciliter l'accès des cellules transplantées à la vascularisation, l'administration systémique dans l'artère fémorale ou de veine de la queue peut être utilisé au lieu d'injections intramusculaires.
L'imagerie par bioluminescence offre l'avantage d'effectuer le suivi à haut débit et non invasive de la survie cellulaire. Lorsqu'il est combiné avec des dosages fonctionnels tels que la perfusion sanguine au laser Doppler ou l'analyse histologique de la néovascularisation, ces techniques peuvent ainsi permettre aux chercheurs d'évaluer l'effet thérapeutique de la transplantation de cellules sur la récupération de l'ischémie des membres postérieurs.
En conclusion, nous avons démontré une méthode simple et reproductible pour la livraison et le suivi de l'ESC-dérivées des cellules endothéliales pour le traitement de l'ischémie des membres postérieurs.
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Acknowledgments
Les auteurs remercient Andrea Axtell, Satoshi Itoh, MD, Jeff Velotta, MD, Grant Hoyt, Robert C. Robbins, MD, Jin Yu, MD, Tim Doyle, PhD, et le Stanford petit noyau d'imagerie animale pour l'assistance technique. Les auteurs remercient également AM Bickford, Inc pour le soutien des équipements vétérinaires. Cette recherche a été financée par des subventions de recherche du National Institutes of Health (R01 HL-75 774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), le tabac en Californie Programme connexes Disease Research de l'Université de Californie (15IT-0257 et 1514RT-0169) , et le California Institute for Regenerative Medicine (RS1-00183).
NH est soutenu par une bourse de l'American Heart Association. peut Heart Association.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Tool | Fine Science Tools | ||
| Syringe needle | Tool | BD Biosciences | 28G insulin syringe is preferred | |
| Phosphate Buffered Saline | Reagent | Invitrogen | ||
| D-luciferin | Reagent | Biosynth International, Inc | Prepare D-luciferin in advance into filtered stock solutions of 15 mg/mL in PBS | |
| IVIS 200 Bioluminescence imaging system and acquisition software | Equipment |  Xenogen Corporation |
References
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