Fabricação de eletrodos amperométrica

Summary

Este protocolo descreve como gerar eletrodos de fibra de carbono. Os eletrodos são posteriormente usados ​​para detectar liberação de catecolaminas a partir de vesículas com amperometria fibra de carbono.

Abstract

Eletrodos de fibra de carbono são cruciais para a detecção de liberação de catecolaminas a partir de vesículas em células isoladas para medições amperometria. Aqui, descrevemos as técnicas necessárias para gerar ruído baixo (<0,5 pA) eletrodos. As técnicas foram modificadas a partir de descrições publicados por pesquisadores anteriores (1,2). Eletrodos são feitos através da preparação de fibras de carbono e enfiar-los individualmente em cada tubo capilar usando um vácuo com um filtro para aspirar a fibra. Em seguida, o tubo capilar com fibras é puxado por um puxador de eletrodo, criando duas metades, cada uma com uma ponta fina pontas. Os eletrodos são mergulhados em epóxi, líquido quente misturado com o endurecedor de criar um selo de epóxi-vidro. Por último, os eletrodos são colocados em um forno para curar o epóxi. Manipulação cuidadosa dos eletrodos é fundamental para garantir que eles são feitos de forma consistente e sem danos. Este protocolo mostra como fabricar e cortar eletrodos amperométricos para a gravação a partir de células individuais.

Protocol

Parte 1: Preparação da fibra do carbono

1. Cortar um feixe de fibras de carbono (usamos 7μm de diâmetro) em um comprimento que é de aproximadamente 1,25 X do comprimento da pipeta capilar.
2. Remover o dimensionamento fervendo ~ 100 mL de acetona em um recipiente e acrescentar as fibras para a acetona, fervente por 30 minutos ou mais.
3. Retire as fibras de acetona quente, e transferir para um copo limpo com 5-10 mL de acetona fresco.
4. Fibras secas, colocando o pacote em um prato de 150 mm abrem Petri e airdry durante a noite.

Parte 2: Tubos de fogo polimento de vidro capilar

1. -Fogo polonês cada tubo capilar (usamos micro-hematócrito tubos capilares, diâmetro externo 1,5 mm, diâmetro interno 1,3 milímetros, 7,5 centímetros de comprimento), mantendo o tubo no centro com uma pinça e expondo o fim da flame.Rotate o tubo sobre 3 vezes, enquanto na chama.
2. Inverter o tubo e coloque a outra extremidade na chama, novamente girando três vezes.
3. Coloque os tubos de fogo polido em um prato de vidro e transferir para o forno até que estejam prontos para serem preenchidos com fibras de carbono.

Parte 3: Enfiar uma fibra de carbono em um tubo capilar

1. Semelhante ao descrito por Machado et al. (2008) e Mundroff e Wightman (2002), chupar a fibra para dentro do tubo de vidro usando tubo de plástico ligado a um vácuo com um filtro.
2. Cortar a fibra usando uma scalpel.Leave ¼ polegada de fora do tubo de fibra.

Parte 4: Puxar Pipetar fibra em um extrator Eletrodo

1. Coloque o tubo capilar para o puxador de eletrodo (usamos Narishige Japão Modelo PP-830) e aperte os botões para segurar o tubo capilar no lugar.
2. Manipular os interruptores para executar dois puxa, definido nas configurações extrator ideal.
3. Uma vez que a pipeta é puxado pela metade, separar as duas metades pelo corte da fibra nua no centro com uma tesoura.
4. Retire cada metade do eletrodo e puxar a fibra salientes para quebrar o vidro da fibra seal.Trim com uma tesoura de modo que apenas 1 / 8 polegadas de fibra é deixado de fora do tubo.
5. Repita os passos 1-4 até cerca de 16 eletrodos de fibra são puxados.

Parte 5: Fazendo Epoxy Glass-Seal

1. Aqueça uma alíquota pré-fabricados de epóxi em uma chapa quente definido para 55 ° C por 6 minutos em uma capela.
2. Enquanto epóxi é aquecimento, wrap ~ 16 dos eletrodos puxado em um pacote usando fita.
3. Após a resina Epon é aquecido por 6 minutos, adicionar 0,7 gramas xof MPDA à resina Epon quente (14%, w / v). Mix agitando o frasco.
4. Mergulhe o feixe de eletrodos no epoxy quente mais solution.After endurecedor cerca de 20 segundos, uma quantidade suficiente de epoxy entrarão as pontas de vidro através de ação capilar.
5. Desfazer o feixe de eletrodos, em lugar de papelão com ranhuras e coloque esta bandeja em um forno definido como 100 ° F.
6. Depois de pelo menos 48 horas, examine cada eletrodo sob uma eletrodos microscope.Discard dissecação que não preencher com epóxi, têm uma ponta quebrou, ter mais de uma fibra, etc.After inspecionar cada eletrodo, colocá-los de volta no suporte de papelão e de volta no oven.Electrodes são geralmente bom para cerca de um mês após a fabricação.

Parte 6: Corte a fibra de carbono

1. Fibra de carbono lugar eletrodo com cuidado sobre uma lâmina de vidro com fita teflon.
2. Visualize a ponta com um microscópio de dissecação.
3. Use uma lâmina de bisturi para cortar limpa perpendicularmente a fibra de carbono para deixar uma superfície plana e limpa para a colocação da fibra de carbono contra uma célula.

Discussion

Este protocolo descreve como gerar e cortar eletrodos amperométricos. Durante as gravações amperométrico, um eletrodo de fibra de carbono é colocada contra a superfície de uma célula secretora. Exocytotic atividade é observado como picos amperométrico, o que indica a corrente eletroquímica causado pela transferência de elétrons após a oxidação das catecolaminas. Com a prática de realizar e cortar eletrodos amperométricos, os níveis de ruído pode ser muito melhorada ao longo de muitos dos eletrodos disponíveis comercialmente.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Epoxy Hardener 1,3-phenylene-diamene flakes	Reagent	Sigma-Aldrich	P23954-100G04 716AJ	Aliquots are stored in a dessicator and should not be exposed to light.
Carbon Fibers	Material	Goodfellow	C005725
Micro-Hematocrit Capillary Tubes	Material	Fisher Scientific	NC9836768
Epoxy Resin	Reagent	Miller-Stephenson	Epon Resin 828
Dissecting Microscope	Instrument
Electrode Puller	Instrument	Narishige International	PP-830	1st pull = 24.8 degrees C; 2nd pull = 62.7 degrees C
Oven	Instrument			set to 100 degrees F.
Hot plate	Instrument			set to 55 degrees C