Biz toplam iç yansıma ve Epifloresans mikroskopi kullanılarak kültürlü astrositler membran ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın ölçmek için nasıl açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm
Bu makalede
Özet
Özet
Beyin glial hücreler içerir. Astrositler, glial hücre tipi, uzun nöronlar için pasif bir destekleyici bir rol sağlamak için bilinmektedir. Ancak, artan kanıtlar astrositler nöronlar ile fonksiyonel etkileşim yoluyla da aktif beyin fonksiyonu katılmak olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, birçok temel yönleri astrosit biyoloji, tartışmalı, belirsiz ve / veya deneysel keşfedilmemiş kalır. Bir önemli konu astrositlerde hücre içi kalsiyum Transientlerin dinamikleri. Kalsiyum önemli bir ikinci haberci olarak iyi kurulmuş ve çünkü astrosit kalsiyum yükselmeler astrositler gelen vericileri serbest bırakılması tetikleyebilir ileri sürülmektedir çünkü bu geçerlidir. Ancak, yakın plazma membranı kalsiyum astrositler sinyal herhangi bir ayrıntılı ve tatmin edici bir açıklama olmamıştır. Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi canlı hücrelerinin plazma membranı yaklaşık 100 nm içinde önemli fizyolojik sinyalleme olaylarını analiz etmek için güçlü bir araçtır. Burada, TIRF mikroskobu kullanımı ve neredeyse aynı anda, plazma membranı ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın izlemek nasıl tarif. Bu yaklaşımın daha rafine ve sistematik bir uygulama astrosit kalsiyum sinyal kesin detaylar hakkında bilgi potansiyeline sahiptir. Astrosit kalsiyum dinamiklerinin ayrıntılı bir anlayış, nasıl, ne zaman ve neden astrositler ve nöron kalsiyum-bağımlı fonksiyonel etkileşimleri tabi anlamak için bir temel sağlayabilir.
Protokol
DENEYSEL PROSEDÜRLER
Deneysel işlemin bir adım daha akıllıca bir şekilde aşağıda açıklanan iki ana bölümden oluşmaktadır.
Bölüm 1: HAZIRLAMA hipokampal astrosit KÜLTÜRLER
Kısaca, karışık, hipokampal astrosit nöron kültürleri iyi kurulmuş bir protokol 1,2,3 kullanılarak hazırlanmıştır. Prosedürü, sağlıklı kültürlü astrositler verim için optimize edilmiş. Aşağıda listelenen tüm işlemler, steril bir ortamda böyle bir laminer akış kaputu gibi yapılmalıdır.
Hazırlanması lamelleri
- 22 mm lamelleri (VWR, 48.380-068)
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Astrositler hücre içi kalsiyum yükselmeler görüntüler çok iyi kurulmuştur. Bu, kendiliğinden meydana gelen nöronal aktivite veya 11 astrosit yüzey reseptörleri aktive agonistleri uygulama tarafından tetiklenebilir. Bir önemli ve tartışmalı bir konu olmadığını astrosit hücre içi kalsiyum yükselmeleri, nöronlar 11, 12 reseptörleri aktive sinyal molekülleri serbest bırakılması tetikleyebilir. Yorum Haydon 7, 13 ve McCarthy 11 laboratuvarları tarafından vurgulanan bu görüşe karşı kanıt olmuştur, çünkü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Bu çalışma, Japonya Uehara Memorial Foundation (ES) yanı sıra Whitehall Vakfı, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme ve Stein-Oppenheimer Endowment Ödülü (BSK) Enstitüsü tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| VWR® Mikro Lamel, Yuvarlak, No. 1 | Araç | VWR international | 48380-068 | |
| Poly-D-lysin hidrobromür | Reaktif | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom bazal membranından elde edilen Laminin | Reaktif | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Earle’s Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) (1X), sıvı | Reaktif | Invitrogen | 14155-063 | |
| Minimum Esansiyel Medium (MEM) (1X), sıvı Earle’s tuzları içerir, ancak L-glutamin veya fenol kırmızısı içermez | Reaktif | Invitrogen | 51200-038 | |
| Penisilin-Streptomisin sıvısı | Reaktif | Invitrogen | 15140-122 | |
| Sodyum piruvat çözeltisi | Reaktif | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| HEPES çözeltisi 1 M | Reaktif | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| N-2 Suplementi (100X), sıvı | Reaktif | Invitrogen | 17502-048 | |
| At Serumu, Isıyla İnatize Edilmiş | Reaktif | Invitrogen | 26050-088 | |
| PAPAIN-022 | Reaktif | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Medium (1X) Fenol Kırmızısı içermeyen sıvı | Reaktif | Invitrogen | 12348-017 | |
| B-27 Serumsuz Suplement (50X), sıvı | Reaktif | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-Glutamin-200 mM (100X), sıvı | Reaktif | Invitrogen | 25030-149 | |
| Hücre Süzgeçleri | Araç | BD Biosciences | 352350 | |
| Kapaklı, Steril, BD Falcon Çok Kuyucuklu Düz Tabanlı Plakalar | Araç | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Reaktif | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Reaktif | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl2 hekzahidrat | Reaktif | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl2 hekzahidrat | Reaktif | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES serbest asit | Reaktif | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-glukoz | Reaktif | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DMSO içinde 1 mM Fluo-4, AM çözeltisi | Reaktif | Invitrogen | F-14217 | |
| DMSO içinde %20 Pluronic® F-127 çözeltisi | Reaktif | Invitrogen | P-3000MP | |
| İmmersiyon Yağı TİP DF | Mikroskop | Cargill Labs | 16242 | |
| 25 mm yuvarlak lamel için açık hazne, 100 μl hacim | Araç | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| Seri 20 hazneler için P-2 platformu, ısıtıcısız | Araç | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| FluoSpheres karboksilat-modifiye mikroküreler, 0.1 μm, sarı-yeşil floresan (505/515) %2 katı | Reaktif | Invitrogen | F8803 |
Kaynaklar
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
